Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобри резултати, препорачуваме да користите понова верзија на вашиот прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме постојана поддршка, ја прикажуваме страницата без стајлинг или JavaScript.
Откривањето и корисната употреба на природни производи може да помогне да се подобри животот на човекот.Хемикалиите за инхибиција на растот на растенијата широко се користат како хербициди за контрола на плевелите.Поради потребата од употреба на различни видови хербициди, се наметнува потребата да се идентификуваат соединенијата со нови механизми на дејство.Во оваа студија, откривме ново соединение N-алкоксипирол, кумамонамид, од Streptomyces werraensis MK493-CF1 и го воспоставивме целосниот процес на синтеза.Преку анализите на биолошката активност, откривме дека urs-моноамската киселина е синтетички посредник на urs-моноамид и потенцијаленинхибитор на растот на растенијата.Дополнително, развивме различни деривати на урбенонска киселина, вклучувајќи го и дериватот на урбенилокси (UDA), кој има висока хербицидна активност без негативно да влијае на растот на клетките HeLa.Откривме и дека дериватите на урмотонична киселина ги нарушуваат растителните микротубули;дополнително, KAND влијае на филаментите на актинот и индуцира клеточна смрт;Овие повеќеслојни ефекти се разликуваат од оние на познатите инхибитори на микротубули и сугерираат нов механизам на дејство за урсонската киселина, што претставува важна предност во развојот на нови хербициди.
Откривањето и практичната примена на корисни природни производи и нивните деривати е средство за подобрување на квалитетот на човечкиот живот.Секундарните метаболити произведени од микроорганизми, растенија и инсекти доведоа до голем напредок во медицината и земјоделството.Многу антибиотици и лекови против леукемија се развиени од природни производи.Покрај тоа, различни видови напестициди, фунгициди и хербициди се екстрахираат од овие природни производи за употреба во земјоделството.Конкретно, хербицидите за контрола на плевелот се важни алатки за зголемување на приносите на културите во современото земјоделство, а различни видови соединенија веќе се користат комерцијално.Неколку клеточни процеси во растенијата, како што се фотосинтезата, метаболизмот на аминокиселините, синтезата на клеточниот ѕид, регулирањето на митозата, сигнализацијата на фитохормонот или синтезата на протеини, се сметаат за типични цели на хербицидите.Соединенијата кои ја инхибираат функцијата на микротубулите се вообичаена класа на хербициди кои влијаат на растот на растенијата со тоа што влијаат на митотичната регулација2.
Микротубулите се компоненти на цитоскелетот и се широко зачувани во еукариотските клетки.Хетеродимерот на тубулин се состои од α-тубулин и β-тубулин кои формираат линеарни протофиламенти на микротубули, со 13 протофиламенти кои формираат цилиндрична структура.Микротубулите играат повеќе улоги во растителните клетки, вклучително и одредување на обликот на клетките, клеточната делба и меѓуклеточниот транспорт3,4.Растителните клетки содржат микротубули под интерфазната плазма мембрана и се смета дека овие таканаречени кортикални микротубули ја контролираат организацијата на целулозните микрофибрили преку регулација на комплексите на целулоза синтаза4,5.Кортикалните микротубули на епидермалните клетки на коренот, присутни во зоната на брзо издолжување на врвот на коренот, се наоѓаат странично, а целулозните микровлакна ги следат овие микротубули и ја ограничуваат насоката на клеточното проширување, а со тоа промовираат анизотропно издолжување на клетките.Затоа, функцијата на микротубулите е тесно поврзана со морфологијата на растенијата.Замените на аминокиселините во гените кои го кодираат тубулинот предизвикуваат искривување на низите на кортикалните микротубули и раст на левата или десната страна кај Arabidopsis 6,7.Слично на тоа, мутациите во протеините поврзани со микротубули кои ја регулираат динамиката на микротубулите, исто така, може да доведат до искривен раст на коренот8,9,10,11,12,13.Дополнително, третманот со хербициди кои ги нарушуваат микротубулите, како што е дисопирамидот, исто така познат како претилахлор, исто така предизвикува левостран кос раст на коренот14.Овие податоци покажуваат дека прецизното регулирање на функцијата на микротубулите е критично за одредување на насоката на раст на растенијата.
Откриени се различни видови на инхибитори на микротубули, и овие лекови дадоа значителен придонес во истражувањето на цитоскелетот, како и во земјоделството и медицината2.Особено, оризалин, динитроанилин соединенија, дисопирамид, соединенија поврзани со бензамид и нивните аналози можат да ја инхибираат функцијата на микротубулите и со тоа да го инхибираат растот на растенијата.Затоа, тие се широко користени како хербициди.Меѓутоа, бидејќи микротубулите се важна компонента на растителните и животинските клетки, повеќето инхибитори на микротубули се цитотоксични за двата типа на клетки.Затоа, и покрај нивната препознаена корист како хербициди, ограничен број на антимикротубуларни агенси се користат за практични цели.
Streptomyces е род од семејството Streptomyces, кој вклучува аеробни, грам-позитивни, филаментозни бактерии и е нашироко познат по својата способност да произведува широк опсег на секундарни метаболити.Затоа, се смета за еден од најважните извори на нови биолошки активни природни производи.Во тековната студија, откривме ново соединение наречено кумамонамид, кое беше изолирано од Streptomyces werraensis MK493-CF1 и S. werraensis ISP 5486. Користејќи спектрална анализа и целосна спектрална анализа, беше карактеризирана структурата на кумамонамидот и неговиот уникатен N-алкоксипирол скелет беше утврдено.синтеза.Урсмонската киселина, синтетичка полумедија на урсмоноамид и неговите деривати, беше откриено дека го инхибира растот и ртењето на популарното моделско растение Arabidopsis thaliana.Во една студија за врската структура-активност, откривме дека соединението со C9 модифицирано во урсонска киселина, наречено нонилокси дериват на урсонска киселина (KAND), значително го подобрува инхибиторниот ефект врз растот и ртење.Имено, новооткриениот инхибитор на раст на растенијата влијаеше и на растот на тутунот и црн дроб и не беше цитотоксичен за бактериите или клетките HeLa.Згора на тоа, некои деривати на урмотонична киселина предизвикуваат искривен фенотип на коренот, што значи дека овие деривати директно или индиректно влијаат на микротубулите.Во согласност со оваа идеја, нашите набљудувања на микротубули означени или имунохистохемиски или со флуоресцентни протеини покажуваат дека третманот со KAND ги деполимеризира микротубулите.Покрај тоа, третманот со деривати на кумамотонска киселина ги наруши микрофиламентите на актин.Така, откривме нов инхибитор на растот на растенијата чиј уникатен механизам на дејство вклучува уништување на цитоскелетот.
Видот MK493-CF1 беше изолиран од почвата во Шинагава-ку, Токио.Видот MK493-CF1 формираше добро разгранет стромален мицелиум.Одредена е делумна секвенца на генот 16S рибозомна РНК (1422 bp).Овој сој е многу сличен на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типичен сој, 99,93%).Врз основа на овој резултат, беше утврдено дека овој сој е тесно поврзан со типот сој на S. werraensis.Затоа, привремено го именувавме овој сој S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T исто така ги произведува истите биоактивни соединенија.Бидејќи имаше малку рани истражувања за добивање природни производи од овој микроорганизам, беа спроведени дополнителни хемиски истражувања.По одгледување на S. werraensis MK493-CF1 на јачмен медиум со ферментација во цврста состојба на 30°C во тек на 14 дена, медиумот беше екстрахиран со 50% EtOH.60 ml од примерокот се суши за да се добијат 59,5 mg суров екстракт.Суровиот екстракт беше подложен на HPLC во обратна фаза за да даде N-метокси-1H-пирол-2-карбоксамид (1, именуван како кумамонамид, 36,0 mg).Вкупната количина од 1 е приближно 60% од суровиот екстракт.Затоа, решивме детално да ги проучуваме својствата на кумамотоамид 1.
Кумамонамид 1 е бел аморфен прав и масената спектрометрија со висока резолуција (HRESIMS) го потврдува C6H8N2O2 (сл. 1).С2-супституираниот пирол фрагмент од ова соединение се карактеризира со δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH во 1H NMR спектар: 4,5 Hz , H-5) и δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), а 13C NMR спектарот покажува присуство на четири sp2 јаглеродни атоми.Присуството на амидната група на позицијата C2 беше оценето со HMBC корелација од C-3 протонот до амидниот карбонил јаглерод на δC 161.1.Дополнително, 1 H и 13 C NMR врвови на δH 4,10 (3H, S) и δC 68,3 укажуваат на присуство на N-метокси групи во молекулата.Иако точната позиција на метокси групата сè уште не била одредена со користење на спектроскопска анализа како што се спектроскопија со зголемена разлика и кратенка на нуклеарната Overhauser (NOEDF), N-метокси-1H-пирол-2-карбоксамид стана првото соединение со кандидати.
За да се одреди правилната структура на 1, беше извршена тотална синтеза (сл. 2а).Третманот на комерцијално достапниот 2-аминопиридин 2 со m-CPBA резултираше со соодветниот N-оксид 3 во квантитативен принос.По 2-аминоазидацијата на 2, реакцијата на циклокондензација опишана од Абрамович беше спроведена во бензен на 90°C за да се добие саканиот 1-хидрокси-1H-пирол-2-карбонитрил 5 во грамови.Брзина 60% (две фази).15,16.Метилацијата и хидролизата на 4 потоа дадоа 1-метокси-1H-пирол-2-карбоксилна киселина (наречена „кумотонска киселина“, 6) со добар принос (70%, два чекора).Конечно, амидацијата преку киселински хлорид посредник 6 користејќи воден амонијак даде Кумамото амид 1 со принос од 98%.Сите спектрални податоци од синтетизираниот 1 беа слични на изолираниот 1, така што беше одредена структурата на 1;
Општа синтеза и анализа на биолошката активност на урбенамидот и урбенската киселина.(а) Вкупна синтеза на Кумамото амид.(б) Седумдневни садници од див тип Arabidopsis Columbia (Col) се одгледуваат на плочите Murashige и Skoog (MS) кои содржат кумамонамид 6 или кумамонамид 1 во наведените концентрации.Лента за скала = 1 cm.
Прво, ги проценивме биолошките активности на урбенамидот и неговите посредници за нивната способност да го модулираат растот на растенијата.Додадовме различни концентрации на урсмонамид 1 или урсмонска киселина 6 во подлогата MS агар и култивиравме садници Arabidopsis thaliana на оваа средина.Овие анализи покажаа дека високите концентрации (500 μM) на 6 го инхибираат растот на коренот (сл. 2б).Следно, генериравме различни деривати со замена на позицијата N1 од 6 и извршивме студии за односот структура-активност на нив (процесот на синтеза на аналогни е опишан во Поддршката информација (SI)).Садниците од Арабидопсис беа одгледувани на средина која содржи 50 μM деривати на урсонична киселина и беше измерена должината на коренот.како што е прикажано на сликата.Како што е прикажано на сликите 3a, b и S1, кумамо киселините имаат различни должини на линеарни алкокси синџири (9, 10, 11, 12 и 13) или големи алкокси синџири (15, 16 и 17) на позицијата N1.Дериватите покажаа значителна инхибиција на растот на коренот.Дополнително, откривме дека примената на 200 μM 10, 11 или 17 го инхибира ртењето (слики 3в и S2).
Проучување на односот структура-активност на Кумамото амид и сродни соединенија.(а) Шема на структура и синтеза на аналози.(б) Квантификација на должината на коренот на садници стари 7 дена одгледувани на MS медиум со или без 50 μM деривати на кумамонамид.Ѕвездичките укажуваат на значајни разлики со лажен третман (т тест, стр< 0,05).n>18. Податоците се прикажани како средна вредност ± SD.nt значи „не тестирано“ затоа што повеќе од 50% од семето не никнале.(в) Квантификација на стапката на 'ртење на третираните семиња инкубирани 7 дена во MS медиум со или без 200 μM кумамонамид и сродни соединенија.Ѕвездичките укажуваат на значајни разлики со лажен третман (хи-квадрат тест).n=96.
Интересно, додавањето на алкилни странични синџири подолги од C9 ја намали инхибиторната активност, што сугерира дека соединенијата поврзани со кумамотинската киселина бараат странични синџири со одредена големина за да ја покажат својата биолошка активност.
Бидејќи анализата на односот структура-активност покажа дека C9 е модифициран во урсонска киселина и неилокси дериватот на урсонска киселина (во понатамошниот текст како KAND 11) е најефективниот инхибитор на растот на растенијата, спроведовме подетална карактеризација на KAND 11. Третман на Arabidopsis со 50 μM KAND 11 речиси целосно го спречи ртењето, додека пониските концентрации (40, 30, 20 или 10 μM) на KAND 11 го инхибираат растот на коренот на начин зависен од дозата (сл. 4а, б).За да тестираме дали KAND 11 влијае на одржливоста на меристемот на коренот, ги испитавме меристемите на коренот обоени со пропидиум јодид (PI) и ја измеривме големината на површината на меристемот.Големината на меристемот на садници одгледувани на медиум кој содржи 25 μM KAND-11 беше 151,1 ± 32,5 μm, додека големината на меристемот на садници одгледувани на контролна средина што содржи DMSO беше 264,7 ± 30,8 μm (сл. 4c, d) , што укажува дека KAND-11 ја обновува клеточната активност.ширење.Корен меристем.Во согласност со ова, третманот со KAND 11 ја намали количината на маркер за клеточна делба CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS сигнал во коренскиот меристем (сл. 4д) 17 .Овие резултати покажуваат дека KAND 11 го инхибира растот на коренот со намалување на активноста на клеточната пролиферација.
Анализа на инхибиторниот ефект на дериватите на урбенонска киселина (урбенилокси деривати) врз растот.(а) 7-дневни садници од див тип Col, одгледувани на MS плочи со наведени концентрации на KAND 11. Лента за скала = 1 cm.(б) Квантификација на должината на коренот.Буквите укажуваат на значајни разлики (Tukey HSD тест, стр< 0,05).n>16. Податоците се прикажани како средна вредност ± SD.(в) Конфокална микроскопија на корени од див тип на Col обоени со пропидиум јодид одгледувани на MS плочи со или без 25 μM KAND 11. Белите загради укажуваат на меристем на коренот.Лента за скала = 100 µm.(г) Квантификација на големината на меристемот на коренот (n = 10 до 11).Статистичките разлики беа утврдени со користење на t-тест (стр< 0,05).Лентите ја претставуваат просечната големина на меристемот.(д) Микроскопија на контраст на диференцијална интерференција (DIC) на кореновиот меристем кој ја содржи конструкцијата CDKB2;1про: CDKB2;1-GUS обоен и обоен на садници стари 5 дена одгледувани на MS плочи со или без 25 µM KAND анализа.
Фитотоксичноста на KAND 11 беше дополнително тестирана со користење на друго двокотиледоно растение, тутунот (Nicotiana tabacum) и главниот модел на организам од копнени растенија, црн дроб (Marchantia polymorpha).Како и во случајот со Arabidopsis, садници од тутун SR-1 одгледувани на средина што содржи 25 μM KAND 11 произведени пократки корени (сл. 5а).Дополнително, 40 од 48 семиња никнаа на чинии што содржат 200 μM KAND 11, додека сите 48 семиња никнаа на лажни подлога, што покажува дека повисоките концентрации на KAND биле значајни (стр< 0,05;чи тест-квадрат) го инхибираше ртењето на тутунот.(Сл. 5б).Дополнително, концентрацијата на KAND 11 што го инхибираше бактерискиот раст во црн дроб беше слична на ефективната концентрација во Arabidopsis (сл. 5в).Овие резултати покажуваат дека KAND 11 може да го инхибира растот на различни растенија.Потоа ја истражувавме можната цитотоксичност на соединенијата поврзани со моноамид на мечка во други организми, имено човечки HeLa клетки и сојот на ешерихија коли DH5α, како претставници на повисоки животински и бактериски клетки, соодветно.Во серија анализи за клеточна пролиферација, забележавме дека кумамонамид 1, кумамонамидна киселина 6 и KAND 11 не влијаеле на растот на клетките HeLa или E. coli во концентрации од 100 μM (сл. 5d, e).
Инхибиција на растот на KAND 11 кај организми кои не се арабидопсис.(а) Садници од див тип SR-1 тутун стари две недели се одгледуваат на вертикално поставени MS плочи кои содржат 25 μM KAND 11. (б) Двенеделни садници од див тип SR-1 тутун се одгледуваат на хоризонтално позиционирани Плочи MS кои содржат 200 μM KAND 11. (в) Двенеделни пупки од див тип Так-1 од црн дроб растени на Gamborg B5 плочи со наведени концентрации на KAND 11. Црвените стрелки покажуваат спори кои престанале да растат во текот на двонеделната инкубација период.(г) Анализа на клеточна пролиферација на HeLa клетките.Бројот на одржливи клетки се мери во фиксни временски интервали со помош на комплет за броење клетки 8 (Доџиндо).Како контрола, HeLa клетките беа третирани со 5 μg/ml актиномицин D (Act D), кој ја инхибира транскрипцијата на RNA полимеразата и предизвикува клеточна смрт.Анализите беа направени во три примероци.(д) Анализа на пролиферација на клетките на E. coli.Растот на E. coli беше анализиран со мерење на OD600.Како контрола, клетките беа третирани со 50 μg/ml ампицилин (Amp), кој ја инхибира синтезата на бактерискиот клеточен ѕид.Анализите беа направени во три примероци.
За да го дешифрираме механизмот на дејство на цитотоксичноста предизвикана од соединенијата поврзани со урамид, ги реанализиравме дериватите на урбенска киселина со умерени инхибиторни ефекти.како што е прикажано на сликата.Како што е прикажано на сликите 2б, 6а, садници одгледувани на плочи со агар кои содржат високи концентрации (200 μM) на урмотонска киселина 6 создале пократки и лево закривени корени (θ = – 23,7 ± 6,1), додека од садници одгледувани на контролната средина, садници произведуваат речиси прави корени (θ = – 3,8 ± 7,1).Познато е дека овој карактеристичен кос раст е резултат на дисфункција на кортикалните микротубули14,18.Во согласност со ова откритие, лековите за дестабилизирање на микротубулите, дисопирамид и оризалин, предизвикаа слично навалување на коренот во нашите услови на раст (Сл. 2б, 6а).Во исто време, тестиравме деривати на урмотонична киселина и избравме неколку од нив кои, при одредени концентрации, предизвикаа кос раст на коренот.Соединенијата 8, 9 и 15 го сменија правецот на раст на коренот на 75 μM, 50 μM и 40 μM, соодветно, што покажува дека овие соединенија можат ефикасно да ги дестабилизираат микротубулите (сл. 2б, 6а).Ние, исто така, го тестиравме најмоќниот дериват на урсолна киселина, KAND 11, на пониска концентрација (15 μM) и откривме дека примената на KAND 11 го инхибира растот на коренот и дека насоката на раст на коренот е нерамна, иако тие имаат тенденција да се наведнуваат налево ( Слика C3)..Бидејќи повисоките концентрации на лекови за дестабилизација на микротубулите понекогаш го инхибираат растот на растенијата наместо да предизвикуваат навалување на коренот, последователно ја проценивме можноста KAND 11 да влијае на микротубулите со набљудување на кортикалните микротубули во епидермалните клетки на коренот.Имунохистохемијата користејќи анти-β-тубулински антитела во епидермалните клетки од корените на расад третирани со 25 μM KAND 11 покажа исчезнување на речиси сите кортикални микротубули во епидермалните клетки во зоната на издолжување (сл. 6б).Овие резултати покажуваат дека кумамотонската киселина и нејзините деривати дејствуваат директно или индиректно на микротубулите за да ги нарушат и дека овие соединенија се нови инхибитори на микротубулите.
Урсонична киселина и нејзините деривати ги менуваат кортикалните микротубули во Arabidopsis thaliana.(а) Аголот на наклонетост на коренот измерен во присуство на различни деривати на урмотонична киселина во наведените концентрации.Анализирани се и ефектите на две соединенија за кои е познато дека ги инхибираат микротубулите: дисопирамид и оризалин.Вметнувањето го покажува стандардот што се користи за мерење на аголот на раст на коренот.Ѕвездичките укажуваат на значајни разлики со лажен третман (т тест, стр< 0,05).n>19. Лента за скала = 1 cm.(б) Кортикални микротубули во епидермалните клетки во зоната на издолжување.Микротубулите во корените на дивиот тип Arabidopsis Col израснати на MS плочи со или без 25 μM KAND 11 беа визуелизирани со имунохистохемиско боење со помош на примарни антитела β-тубулин и секундарни антитела конјугирани со Alexa Флуор.Лента за скала = 10 µm.(в) Митотична структура на микротубулите во коренскиот меристем.Микротубулите беа визуелизирани со користење на имунохистохемиско боење.Митотичните структури, вклучително и профазни зони, вретена и фрагмопласти, беа изброени од конфокални слики.Стрелките укажуваат на митотичните микротубули структури.Ѕвездичките укажуваат на значајни разлики со лажен третман (т тест, стр< 0,05).n>9. Лента за скала = 50 µm.
Иако Ursa има способност да ја наруши функцијата на микротубулите, неговиот механизам на дејство се очекува да биде различен од типичните агенси за деполимеризација на микротубулите.На пример, повисоките концентрации на агенси за деполимеризација на микротубулите, како што се дисопирамидот и оризалинот, предизвикуваат анизотропно проширување на епидермалните клетки, додека KAND 11 не.Дополнително, коапликацијата на KAND 11 и дисопирамид резултираше со комбиниран одговор на растот на коренот индуциран од дисопирамид и беше забележана инхибиција на растот индуцирана од KAND 11 (сл. S4).Ние, исто така, го анализиравме одговорот на хиперсензитивниот дизопирамид 1-1 (phs1-1) мутант на KAND 11. phs1-1 има не-канонска точкаста мутација на тубулин киназа и произведува пократки корени кога се третира со дисопирамид9,20.phs1-1 мутантните садници одгледувани на агарска средина која содржи KAND 11 имале пократки корени слични на оние одгледувани на дисопирамида (сл. S5).
Покрај тоа, ги набљудувавме митотичните микротубули структури, како што се профазни зони, вретена и фрагмопласти, во коренскиот меристем на садници третирани со KAND 11. Во согласност со набљудувањата за CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, значително намалување на беше забележан бројот на митотични микротубули (сл. .6в).
За да се карактеризира цитотоксичноста на KAND 11 при субцелуларна резолуција, ги третиравме суспензивните клетки на тутунот BY-2 со KAND 11 и го набљудувавме нивниот одговор.Прво додадовме KAND 11 на BY-2 клетки кои изразуваат TagRFP-TUA6, кој флуоресцентно ги означува микротубулите, за да го процени ефектот на KAND 11 врз кортикалните микротубули.Густината на кортикалните микротубули беше проценета со помош на анализа на сликата, која го квантифицираше процентот на цитоскелетни пиксели меѓу цитоплазматските пиксели.Резултатите од анализата покажаа дека по третман со 50 μM или 100 μM KAND 11 за 1 час, густината значително се намали на 0,94 ± 0,74% или 0,23 ± 0,28%, соодветно, додека густината на клетките третирани со DMSO, изнесуваше 1,631 ± % (сл. 7а).Овие резултати се во согласност со набљудувањето во Arabidopsis дека третманот со KAND 11 индуцира деполимеризација на кортикалните микротубули (сл. 6б).Ние, исто така, ја испитавме линијата BY-2 со актин филаменти означени со GFP-ABD по третман со иста концентрација на KAND 11 и забележавме дека третманот со KAND 11 ги нарушува актинските филаменти.Третманот со 50 μM или 100 μM KAND 11 за 1 час значително ја намали густината на филаментот на актин на 1,20 ± 0,62% или 0,61 ± 0,26%, соодветно, додека густината во клетките третирани со DMSO беше 1,69 ± 0,52% (сл. 0,52%).7б).Овие резултати се во контраст со ефектите на пропизамидот, кој не влијае на актинските филаменти, и латрункулин Б, деполимеризатор на актин кој не влијае на микротубулите (SI Слика S6).Дополнително, третманот со кумамонамид 1, кумамонамидна киселина 6 или KAND 11 не влијаеше на микротубулите во клетките HeLa (SI Слика S7).Така, се верува дека механизмот на дејство на KAND 11 е различен од оној на познатите цитоскелетни прекинувачи.Дополнително, нашето микроскопско набљудување на BY-2 клетките третирани со KAND 11 го откри почетокот на клеточната смрт за време на третманот KAND 11 и покажа дека процентот на мртвите клетки обоени со сино Еванс не се зголеми значително по 30 минути од третманот KAND 11, додека по 90 минути третман со 50 μM или 100 μM KAND, бројот на мртви клетки се зголеми на 43,7% или 80,1%, соодветно (сл. 7в).Земени заедно, овие податоци покажуваат дека новиот дериват на урсолна киселина KAND 11 е растителен специфичен цитоскелет инхибитор со претходно непознат механизам на дејство.
KAND влијае на кортикалните микротубули, актинските филаменти и одржливоста на BY-2 клетките на тутунот.(а) Визуелизација на кортикални микротубули во BY-2 клетки во присуство на TagRFP-TUA6.Клетките BY-2 третирани со KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO беа испитани со конфокална микроскопија.Густината на кортикалните микротубули беше пресметана од микрографи на 25 независни клетки.Буквите укажуваат на значајни разлики (Tukey HSD тест, стр< 0,05).Лента за скала = 10 µm.(б) Кортикални актин филаменти во BY-2 клетки визуелизирани во присуство на GFP-ABD2.Клетките BY-2 третирани со KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO беа испитани со конфокална микроскопија.Густината на кортикалните актински филаменти беше пресметана од микрографи на 25 независни клетки.Буквите укажуваат на значајни разлики (Tukey HSD тест, стр< 0,05).Лента за скала = 10 µm.(в) Набљудување на мртвите BY-2 клетки со Евансовото сино боење.Клетките BY-2 третирани со KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO беа испитани со микроскопија со светло поле.n=3.Лента за скала = 100 µm.
Откривањето и примената на нови природни производи доведе до значителен напредок во различни аспекти на човечкиот живот, вклучително и медицината и земјоделството.Историски истражувања се направени за да се добијат корисни соединенија од природни ресурси.Особено, познато е дека актиномицетите се корисни како антипаразитски антибиотици за нематоди поради нивната способност да произведуваат различни секундарни метаболити како што се авермектин, оловното соединение на ивермектин и блеомицин и неговите деривати, кои се користат во медицински цели како антиканцероген агенс21,22.Слично на тоа, различни хербицидни соединенија се откриени од актиномицетите, од кои некои веќе се користат комерцијално1,23.Затоа, анализата на метаболитите на актиномицетите за да се изолираат природни производи со посакувани биолошки активности се смета за ефикасна стратегија.Во оваа студија откривме ново соединение, кумамонамид, од S. werraensis и успешно го синтетизиравме.Урсонична киселина е синтетичка полумедија на урбенамидот и неговите деривати.Може да предизвика карактеристично виткање на коренот, да покаже умерена до силна хербицидна активност и директно или индиректно да ги оштети растителните микротубули.Сепак, механизмот на дејство на урмотонската киселина може да се разликува од оној на постоечките инхибитори на микротубули, бидејќи KAND 11, исто така, ги нарушува актинските филаменти и предизвикува клеточна смрт, што укажува на регулаторен механизам со кој урмотонската киселина и нејзините деривати влијаат на широк опсег на цитоскелетни структури..
Понатамошната детална карактеризација на урбенонската киселина ќе помогне подобро да се разбере механизмот на дејство на урбенонската киселина.Конкретно, следната цел е да се оцени способноста на урсонската киселина да се врзува за редуцирани микротубули за да се утврди дали урсонската киселина и нејзините деривати делуваат директно на микротубулите и ги деполимеризираат или дали нивното дејство резултира со дестабилизација на микротубулите.Дополнително, во случај кога микротубулите не се директна цел, идентификувањето на местото на дејство и молекуларните цели на урсонската киселина на растителните клетки ќе помогне дополнително да се разберат својствата на поврзаните соединенија и можните начини за подобрување на хербицидната активност.Нашата анализа на биоактивност ја откри уникатната цитотоксична способност на урсонската киселина врз растот на растенијата како Arabidopsis thaliana, тутунот и црн дроб, додека ниту E. coli ниту HeLa клетките не беа засегнати.Мала или никаква токсичност за животинските клетки е предност на дериватите на урсонска киселина доколку се развиени како хербициди за употреба на отворени земјоделски полиња.Навистина, бидејќи микротубулите се вообичаени структури кај еукариотите, нивната селективна инхибиција кај растенијата е клучен услов за хербицидите.На пример, пропизамидот, средство за деполимеризација на микротубули што директно се врзува за тубулин и ја инхибира полимеризацијата, се користи како хербицид поради неговата мала токсичност за животинските клетки24.За разлика од дисопирамидот, сродните бензамиди имаат различни целни специфичности.Покрај растителните микротубули, RH-4032 или бензоксамид исто така ги инхибира микротубулите на животинските клетки или оомицетите, соодветно, а залиламид се користи како фунгицид поради неговата ниска фитотоксичност25,26,27.Новооткриената мечка и нејзините деривати покажуваат селективна цитотоксичност против растенијата, но вреди да се напомене дека понатамошните модификации може да ја променат нивната целна специфичност, потенцијално обезбедувајќи дополнителни деривати за контрола на патогени габи или оомицети.
Уникатните својства на урбенонската киселина и нејзините деривати се корисни за нивниот развој како хербициди и употреба како истражувачки алатки.Важноста на цитоскелетот во контролирањето на обликот на растителните клетки е широко препознаена.Претходните студии покажаа дека растенијата еволуирале сложени механизми за организација на кортикалните микротубули преку контролирање на динамиката на микротубулите за правилно контролирање на морфогенезата.Идентификувани се голем број на молекули одговорни за регулирање на активноста на микротубулите, а поврзаните истражувања сè уште се во тек3,4,28.Нашето сегашно разбирање за динамиката на микротубулите во растителните клетки не ги објаснува целосно механизмите на организација на кортикалните микротубули.На пример, иако и дисопирамидот и оризалинот можат да ги деполимеризираат микротубулите, дисопирамидот предизвикува сериозно нарушување на коренот додека оризалинот има релативно благ ефект.Покрај тоа, мутациите во тубулинот, кој ги стабилизира микротубулите, исто така предизвикуваат декстроротација на корените, додека паклитакселот, кој исто така ја стабилизира динамиката на микротубулите, не.Затоа, проучувањето и идентификувањето на молекуларните цели на урсолната киселина треба да обезбеди нови сознанија за регулацијата на растителните кортикални микротубули.Слично на тоа, идните споредби на хемикалии кои се ефикасни во промовирање на нарушен раст, како што е дисопирамидот, и помалку ефективни хемикалии, како што се оризалин или кумамоторна киселина, ќе дадат индиции за тоа како се јавува искривен раст.
Од друга страна, цитоскелетните преуредувања поврзани со одбраната се уште една можност да се објасни цитотоксичноста на урсонската киселина.Инфекцијата на патогенот или воведувањето на предизвикувач во растителните клетки понекогаш предизвикува уништување на цитоскелетот и последователна клеточна смрт29.На пример, криптоксантинот добиен од оомицети е пријавен дека ги нарушува микротубулите и актинските филаменти пред смртта на клетките на тутунот, слично на она што се случува со третманот KAND30,31.Сличностите помеѓу одбранбените реакции и клеточните реакции предизвикани од урсонската киселина нè наведоа да претпоставиме дека тие предизвикуваат заеднички клеточни процеси, иако евидентен е побрз и посилен ефект на урсонската киселина од криптоксантинот.Сепак, студиите покажаа дека нарушувањето на актинските филаменти промовира спонтана клеточна смрт, која не е секогаш придружена со нарушување на микротубулите29.Дополнително, останува да се види дали патогенот или предизвикувачот предизвикува нарушен раст на коренот, како што прават дериватите на урсонската киселина.Така, молекуларното знаење што ги поврзува одбранбените одговори и цитоскелетот е атрактивен проблем што треба да се реши.Со искористување на присуството на соединенија со ниска молекуларна тежина поврзани со урсонската киселина, како и низа деривати со различна моќ, тие може да обезбедат можности за таргетирање на непознати клеточни механизми.
Земени заедно, откривањето и примената на нови соединенија кои ја модулираат динамиката на микротубулите ќе обезбеди моќни методи за решавање на сложените молекуларни механизми кои се во основата на одредувањето на обликот на растителните клетки.Во овој контекст, неодамна развиеното соединение урмотонска киселина, кое влијае на микротубулите и актинските филаменти и предизвикува клеточна смрт, може да обезбеди можност да се дешифрира врската помеѓу контролата на микротубулите и овие други механизми.Така, хемиската и биолошката анализа користејќи урбенонска киселина ќе ни помогне да ги разбереме молекуларните регулаторни механизми кои го контролираат растителниот цитоскелет.
Инокулирајте S. werraensis MK493-CF1 во 500 mL збунета ерленмаерска колба која содржи 110 mL семенски медиум кој се состои од 2% (w/v) галактоза, 2% (w/v) паста есенција, 1% (w/v) состав Bacto .-сојтон (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) екстракт од пченка (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 и 0,2% CaCO3 во дејонизирана вода.(pH 7,4 пред стерилизација).Семенските култури се инкубираат на ротационен шејкер (180 вртежи во минута) на 27°C 2 дена.Производно одгледување преку ферментација во цврста состојба.Културата на семето (7 ml) беше префрлена во колба К-1 од 500 ml која содржи 40 g производствен медиум кој се состои од 15 g пресуван јачмен (MUSO Co., Ltd., Јапонија) и 25 g дејонизирана вода (pH не е прилагодена пред стерилизација).).Ферментацијата се вршеше на 30°C во темница 14 дена.Материјалот за ферментација беше екстрахиран со 40 ml/шише EtOH и центрифугиран (1500 g, 4°C, 10 мин).Супернатантот на културата (60 ml) беше екстрахиран со мешавина од 10% MeOH/EtOAc.Органскиот слој беше испаруван под намален притисок за да се добие остаток (59,5 mg), кој беше подложен на HPLC со градиентно елуирање (0-10 минути: 90%) на колона од обратна фаза (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × должина 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 минути: 90% H2O/CH3CN до 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минути: 90% H2O/EtOH, 45–155 минути: 90% H2O /EtOH до 100% EtOH (градиент (градиент), 155-200 мин: 100% EtOH) со брзина на проток од 1,5 ml/min, кумамонамид (1, 36,0 mg) беше изолиран како бел аморфен прав.
Кумамотоамид (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ пресметана вредност: 141,0659, измерена вредност: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 157 cm.
Семињата од Колумбија (Col-0) беа добиени од Центарот за биолошки ресурси на Arabidopsis (ABRC) со дозвола за истражувачка употреба.Семињата Col-0 беа размножени и одржувани во наши лабораториски услови и се користеа како растенија од див тип Arabidopsis.Семињата на Arabidopsis беа површински стерилизирани и култивирани во медиум Murashige и Skoog со половина јачина што содржи 2% сахароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-морфолино)етансулфонска киселина (MES) ( Fujifilm Wako Pure C ).) и 1,5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, на 23 °C и постојана светлина.Семињата на мутантот phs1-1 беа обезбедени од Т. Хашимото (Институт за наука и технологија Нара).
Семињата на сојот SR-1 беа обезбедени од Т. Хашимото (Нара Институт за наука и технологија) и се користеа како растенија од див тутун.Семињата од тутун беа површински стерилизирани и натопени во стерилна вода три ноќи за да се поттикне ртење, а потоа се ставаа во раствор со полујачина што содржи 2% сахароза, 0,05% (w/v) MES и 0,8% гелан гума (Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурашиге.и Skoog медиум) со pH 5,7 и инкубирани на 23°C под постојана светлина.
Вирус Так-1 беше обезбеден од Т. Кохчи (Универзитет во Кјото) и беше користен како стандардна експериментална единица за студијата за црн дроб.Гема беше добиена од стерилизирани култивирани растенија, а потоа поплочена на медиум Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) што содржи 1% сахароза и 0,3% гелан гума и се инкубираше на 23°C под континуирано светло.
Тутунските BY-2 клетки (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) беа обезбедени од S. Hasezawa (Универзитет во Токио).Клетките BY-2 беа разредени 95 пати во модифициран медиум Linsmeier и Skoog и се дополнуваа неделно со 2,4-дихлорофеноксиоцетна киселина 32 .Клеточната суспензија беше измешана на ротационен шејкер со 130 вртежи во минута на 27°C во темница.Измијте ги клетките со 10 пати поголем волумен на свеж медиум и повторно суспендирајте во истиот медиум.BY-2 трансгенски клеточни линии кои стабилно го изразуваат маркерот на микротубулите TagRFP-TUA6 или маркерот на актин филамент GFP-ABD2 под промоторот 35S на вирусот на мозаик од карфиол, беа генерирани како што е опишано33,34,35.Овие клеточни линии може да се одржуваат и синхронизираат користејќи процедури слични на оние што се користат за оригиналната клеточна линија BY-2.
HeLa клетките беа култивирани во Dulbecco's модифициран Eagle's медиум (DMEM) (Life Technologies) дополнет со 10% фетален говедски серум, 1,2 U/ml пеницилин и 1,2 μg/ml стрептомицин во инкубатор на 37°C со 5% CO2.
Сите експерименти опишани во овој ракопис беа извршени во согласност со јапонските прописи и упатства за биобезбедност.
Соединенијата беа растворени во диметил сулфоксид (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) како матични раствори и разредени во MS медиум за Arabidopsis и тутун или Gamborg B5 медиум за црн дроб.За анализата за инхибиција на растот на коренот, повеќе од 10 семиња по чинија беа посеани на агар медиум кој ги содржи наведените соединенија или DMSO.Семињата се инкубираат во комора за раст 7 дена.Садниците беа фотографирани и измерена е должината на корените.За анализа на ртење на Arabidopsis, 48 семиња по чинија беа посеани на агар медиум кој содржи 200 μM соединение или DMSO.Семињата на Arabidopsis беа одгледувани во комора за растење и бројот на никнати садници се броеше 7 дена по ртење (dag).За анализа на ртење на тутун, 24 семиња по чинија беа посеани на агар медиум кој содржи 200 μM KAND или DMSO.Семето од тутун се одгледувало во комора за растење и бројот на никнати садници се броел по 14 дена.За анализата за инхибиција на растот на црниот дроб, 9 ембриони од секоја плоча беа поплочени на агарска средина која ги содржи наведените концентрации на KAND или DMSO и се инкубираат во комора за раст 14 дена.
Користете садници обоени со 5 mg/ml пропидиум јодид (PI) за да ја визуелизирате организацијата на кореновиот меристем.PI сигналите беа забележани со флуоресцентна микроскопија со користење на TCS SPE конфокален ласерски микроскоп за скенирање (Leica Microsystems).
Хистохемиското боење на корените со β-глукуронидаза (GUS) беше извршено според протоколот опишан од Malami и Benfey36.Садниците беа фиксирани во 90% ацетон преку ноќ, обоени со 0,5 mg/ml 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-d-глукуронска киселина во GUS пуфер за 1 час и ставени во хидриран раствор на хлоралдехид.(8 g хлорал хидрат, 2 ml вода и 1 ml глицерол) и набљудувано со контрастна микроскопија со диференцијална интерференција со помош на микроскоп Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Аглите на коренот беа измерени на садници стари 7 дена, одгледувани на вертикално поставени плочи.Измерете го аголот на коренот од насоката на векторот на гравитацијата како што е опишано во чекор 6.
Распоредот на кортикалните микротубули беше забележан како што е опишано, со мали измени на протоколот 37 .Анти-β-тубулин антитела (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) и Alexa Fluor 488-конјугиран анти-глувче IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) беа користени како примарни и секундарни антитела при разредување 1:1000 и 1:100, соодветно.Сликите на флуоресценција беа добиени со помош на TCS SPE конфокален ласерски микроскоп за скенирање (Leica Microsystems).Добијте слики со Z-оџак и креирајте проекции со максимален интензитет според упатствата на производителот.
Анализата за пролиферација на клетките HeLa беше изведена со употреба на комплет за броење клетки 8 (Dojindo) според упатствата на производителот.
Растот на E. coli DH5α беше анализиран со мерење на густината на клетките во културата користејќи спектрофотометар на 600 nm (OD600).
Цитоскелетната организација во трансгенските BY-2 клетки беше забележана со помош на флуоресцентен микроскоп опремен со уред за конфокално скенирање CSU-X1 (Yokogawa) и sCMOS камера (Zyla, Andor Technology).Цитоскелетната густина беше проценета со анализа на сликата, која го квантифицираше процентот на цитоскелетни пиксели меѓу цитоплазматските пиксели во конфокалните слики користејќи софтвер ImageJ како што е опишано38,39.
За да се открие клеточна смрт во клетките BY-2, дел од клеточната суспензија беше инкубирана со 0,05% Еванс сино 10 минути на собна температура.Селективно Евансовото сино боење на мртвите клетки зависи од истиснувањето на бојата од одржливите клетки од непроменетата плазма мембрана40.Обоените клетки беа забележани со помош на микроскоп со светло поле (BX53, Olympus).
HeLa клетките беа одгледувани во DMEM дополнет со 10% FBS во навлажнет инкубатор на 37°C и 5% CO2.Клетките беа третирани со 100 μM KAND 11, кумамонаминска киселина 6, кумамонамид 1, 100 ng/ml колцемид (Gibco) или 100 ng/ml Нокодмазе (Sigma) 6 часа на 37°C.Клетките беа фиксирани со MetOH 10 мин, а потоа со ацетат 5 мин на собна температура.Фиксираните клетки беа инкубирани со β-тубулин примарно антитело (1D4A4, Proteintech: 66240-1) разредено во 0,5% BSA/PBS 2 часа, измиени 3 пати со TBST, а потоа инкубирани со Alexa Fluor козјо антитело.488 1 час.– IgG на глушец (Thermo Fisher Scientific: A11001) и 15 ng/ml 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) разреден во 0,5% BSA/PBS.По трипати миење со TBST, обоените клетки беа забележани на превртен микроскоп Nikon Eclipse Ti-E.Сликите се снимени со оладена Hamamatsu ORCA-R2 CCD камера со помош на софтверот MetaMorph (Molecular Devices).
Време на објавување: 17.06.2024