Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена CSS поддршка. За најдобри резултати, препорачуваме да користите понова верзија на вашиот прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ја прикажуваме страницата без стилизирање или JavaScript.
Откривањето и корисната употреба на природни производи може да помогне во подобрувањето на човечкиот живот. Хемикалиите што го инхибираат растот на растенијата се широко користени како хербициди за контрола на плевелите. Поради потребата од употреба на различни видови хербициди, постои потреба да се идентификуваат соединенија со нови механизми на дејство. Во оваа студија, откривме ново N-алкоксипиролско соединение, кумамонамид, од Streptomyces werraensis MK493-CF1 и го воспоставивме комплетниот процес на синтеза. Преку тестови за биолошка активност, откривме дека урс-моноамската киселина е синтетички меѓупроизвод на урс-моноамид и потенцијален...инхибитор на раст на растенијатаПокрај тоа, развивме различни деривати на урбенонска киселина, вклучувајќи го и дериватот на урбенилокси (UDA), кој има висока хербицидна активност без негативно влијание врз растот на HeLa клетките. Исто така, откривме дека дериватите на урмотонската киселина ги нарушуваат растителните микротубули; покрај тоа, KAND влијае на актинските филаменти и предизвикува клеточна смрт; Овие повеќеслојни ефекти се разликуваат од оние на познатите инхибитори на микротубулите и сугерираат нов механизам на дејство на урсонската киселина, што претставува важна предност во развојот на нови хербициди.
Откривањето и практичната примена на корисни природни производи и нивните деривати е средство за подобрување на квалитетот на човечкиот живот. Секундарните метаболити произведени од микроорганизми, растенија и инсекти доведоа до голем напредок во медицината и земјоделството. Многу антибиотици и лекови против леукемија се развиени од природни производи. Покрај тоа, разни видови напестициди, фунгицидите и хербицидите се екстрахираат од овие природни производи за употреба во земјоделството. Особено, хербицидите за контрола на плевелите се важни алатки за зголемување на приносите на земјоделските култури во современото земјоделство, а различни видови соединенија веќе се користат комерцијално. Неколку клеточни процеси во растенијата, како што се фотосинтезата, метаболизмот на аминокиселините, синтезата на клеточниот ѕид, регулирањето на митозата, сигнализацијата на фитохормоните или синтезата на протеини, се сметаат за типични цели на хербицидите. Соединенијата што ја инхибираат функцијата на микротубулите се вообичаена класа на хербициди кои влијаат на растот на растенијата со влијание врз митотичната регулација2.
Микротубулите се компоненти на цитоскелетот и се широко зачувани во еукариотските клетки. Тубулинскиот хетеродимер се состои од α-тубулин и β-тубулин кои формираат линеарни протофиламенти на микротубулите, при што 13 протофиламенти формираат цилиндрична структура. Микротубулите играат повеќекратни улоги во растителните клетки, вклучувајќи го одредувањето на обликот на клетките, клеточната делба и интрацелуларниот транспорт3,4. Растителните клетки содржат микротубули под интерфазната плазма мембрана, а се смета дека овие таканаречени кортикални микротубули ја контролираат организацијата на целулозните микрофибрили преку регулирање на комплексите на целулозна синтаза4,5. Кортикалните микротубули на клетките на коренот, присутни во зоната на брзо издолжување на врвот на коренот, се наоѓаат странично, а целулозните микровлакна ги следат овие микротубули и го ограничуваат правецот на ширење на клетките, со што се промовира анизотропно издолжување на клетките. Затоа, функцијата на микротубулите е тесно поврзана со морфологијата на растенијата. Замените на аминокиселини во гените што го кодираат тубулинот предизвикуваат искривување на кортикалните низи на микротубули и раст на левата или десната страна кај Arabidopsis 6,7. Слично на тоа, мутациите во протеините поврзани со микротубулите што ја регулираат динамиката на микротубулите, исто така, можат да доведат до нарушен раст на коренот 8,9,10,11,12,13. Покрај тоа, третманот со хербициди што ги нарушуваат микротубулите, како што е дисопирамидот, познат и како претилахлор, исто така предизвикува левостран кос раст на коренот 14. Овие податоци укажуваат дека прецизната регулација на функцијата на микротубулите е клучна за одредување на насоката на раст на растенијата.
Откриени се различни видови инхибитори на микротубулите, а овие лекови дале значаен придонес во истражувањата на цитоскелетот, како и во земјоделството и медицината2. Особено, оризалинот, динитроанилинските соединенија, дисопирамидот, соединенијата поврзани со бензамид и нивните аналози можат да ја инхибираат функцијата на микротубулите и со тоа да го инхибираат растот на растенијата. Затоа, тие се широко користени како хербициди. Сепак, бидејќи микротубулите се важна компонента на растителните и животинските клетки, повеќето инхибитори на микротубулите се цитотоксични за двата типа клетки. Затоа, и покрај нивната препознаена корисност како хербициди, ограничен број на антимикротубулни агенси се користат за практични цели.
Streptomyces е род од семејството Streptomyces, кое вклучува аеробни, грам-позитивни, филаментозни бактерии и е широко познато по својата способност да произведува широк спектар на секундарни метаболити. Затоа, се смета за еден од најважните извори на нови биолошки активни природни производи. Во оваа студија, откривме ново соединение наречено кумамонамид, кое беше изолирано од Streptomyces werraensis MK493-CF1 и S. werraensis ISP 5486. Користејќи спектрална анализа и целосна спектрална анализа, беше окарактеризирана структурата на кумамонамид и беше определен неговиот уникатен N-алкоксипиролски скелет. Урмонската киселина, синтетички меѓупроизвод на урсмоноамид и неговите деривати, беше откриено дека го инхибира растот и 'ртењето на популарното моделно растение Arabidopsis thaliana. Во студија за односот структура-активност, откривме дека соединение со C9 модифициран во урсонична киселина, наречено нонилокси дериват на урсонична киселина (KAND), значително го подобрува инхибиторниот ефект врз растот и 'ртењето. Имено, новооткриениот инхибитор на раст на растенијата, исто така, влијаел на растот на тутунот и црниот дроб и не бил цитотоксичен за бактериите или клетките HeLa. Покрај тоа, некои деривати на урмотонска киселина индуцираат нарушен фенотип на коренот, што имплицира дека овие деривати директно или индиректно влијаат на микротубулите. Во согласност со оваа идеја, нашите набљудувања на микротубули обележани или имунохистохемиски или со флуоресцентни протеини укажуваат дека третманот со KAND ги деполимеризира микротубулите. Покрај тоа, третманот со деривати на кумамотонска киселина ги нарушува актинските микрофиламенти. Така, откривме нов инхибитор на раст на растенијата чиј уникатен механизам на дејство вклучува уништување на цитоскелетот.
Сојот MK493-CF1 беше изолиран од почва во Шинагава-ку, Токио. Сојот MK493-CF1 формираше добро разгранет стромален мицелиум. Беше утврдена делумната секвенца на генот за 16S рибозомална РНК (1422 bp). Овој сој е многу сличен на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типичен сој, 99,93%). Врз основа на овој резултат, беше утврдено дека овој сој е тесно поврзан со типскиот сој на S. werraensis. Затоа, привремено го именувавме овој сој S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T исто така произведува исти биоактивни соединенија. Бидејќи имаше малку рани истражувања за добивање природни производи од овој микроорганизам, беа спроведени понатамошни хемиски истражувања. По култивирање на S. werraensis MK493-CF1 на јачменова подлога со ферментација во цврста состојба на 30°C во тек на 14 дена, подлогата беше екстрахирана со 50% EtOH. 60 ml од примерокот беше сушена за да се добијат 59,5 mg суров екстракт. Суровиот екстракт беше подложен на HPLC со обратна фаза за да се добие N-метокси-1H-пирол-2-карбоксамид (1, именуван кумамонамид, 36,0 mg). Вкупната количина на 1 е приближно 60% од суровиот екстракт. Затоа, решивме детално да ги проучиме својствата на кумамотоамид 1.
Кумамонамид 1 е бел аморфен прав, а масената спектрометрија со висока резолуција (HRESIMS) го потврдува C6H8N2O2 (сл. 1). C2-супституираниот пиролски фрагмент на ова соединение се карактеризира со δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH во 1H NMR спектар: 4,5 Hz, H-5) и δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), а 13C NMR спектарот покажува присуство на четири sp2 јаглеродни атоми. Присуството на амид група на позицијата C2 беше оценето со HMBC корелација од C-3 протонот до амид карбонилниот јаглерод на δC 161,1. Дополнително, врвовите на 1H и 13C NMR на δH 4,10 (3H, S) и δC 68,3 укажуваат на присуство на N-метокси групи во молекулата. Иако точната позиција на метокси групата сè уште не беше утврдена со употреба на спектроскопска анализа како што се подобрена диференцијална спектроскопија и кратенката нуклеарен Оверхаузер (NOEDF), N-метокси-1H-пирол-2-карбоксамид стана првото кандидатско соединение.
За да се утврди точната структура на 1, извршена е целосна синтеза (Сл. 2а). Третманот на комерцијално достапниот 2-аминопиридин 2 со m-CPBA резултираше со соодветниот N-оксид 3 во квантитативен принос. По 2-аминоазидацијата на 2, реакцијата на циклокондензација опишана од Абрамович беше спроведена во бензен на 90°C за да се добие посакуваниот 1-хидрокси-1H-пирол-2-карбонитрил 5 во грамови. Брзина 60% (две фази). 15,16. Метилацијата и хидролизата на 4 потоа дадоа 1-метокси-1H-пирол-2-карбоксилна киселина (наречена „кумотонска киселина“, 6) со добар принос (70%, два чекори). Конечно, амидацијата преку кисел хлорид меѓупроизвод 6 со употреба на воден амонијак даде Кумамото амид 1 со принос од 98%. Сите спектрални податоци на синтетизираниот 1 беа слични на изолираниот 1, па затоа беше одредена структурата на 1;
Општа синтеза и анализа на биолошката активност на урбенамид и урбенска киселина. (а) Вкупна синтеза на Кумамото амид. (б) Седумдневни садници од див тип Arabidopsis Columbia (Col) беа одгледувани на плочи од Murashige и Skoog (MS) кои содржат кумамонамид 6 или кумамонамид 1 при наведените концентрации. Ширина на скалата = 1 cm.
Прво, ги проценивме биолошките активности на урбенамид и неговите меѓупроизводи за нивната способност да го модулираат растот на растенијата. Додадовме различни концентрации на урсмонамид 1 или урсмонична киселина 6 во MS агар медиум и култивиравме садници од Arabidopsis thaliana на овој медиум. Овие анализи покажаа дека високите концентрации (500 μM) од 6 го инхибираат растот на коренот (Сл. 2б). Потоа, генериравме различни деривати со замена на N1 позицијата на 6 и извршивме студии за односот структура-активност врз нив (процесот на аналогна синтеза е опишан во Дополнителните информации (SI)). Садниците од Arabidopsis беа одгледувани на медиум што содржи 50 μM деривати на урсонична киселина, а должината на коренот беше измерена, како што е прикажано на сликата. Како што е прикажано на сликите 3а, б и S1, кумамо киселините имаат различни должини на линеарни алкокси ланци (9, 10, 11, 12 и 13) или големи алкокси ланци (15, 16 и 17) на N1 позицијата. Дериватите покажаа значајна инхибиција на растот на коренот. Покрај тоа, откривме дека примената на 200 μM 10, 11 или 17 го инхибираше ртењето (сл. 3c и S2).
Студија за односот структура-активност на Кумамото амид и сродни соединенија. (а) Структура и шема на синтеза на аналози. (б) Квантификација на должината на коренот на 7-дневни садници одгледувани на MS медиум со или без 50 μM деривати на кумамонамид. Ѕвездичките означуваат значајни разлики со лажниот третман (t тест, p< 0,05). n>18. Податоците се прикажани како средна вредност ± SD. nt значи „не е тестирано“ бидејќи повеќе од 50% од семето не 'ртело. (c) Квантификација на стапката на 'ртење на третирани семиња инкубирани 7 дена во MS медиум со или без 200 μM кумамонамид и сродни соединенија. Ѕвездичките означуваат значајни разлики со лажниот третман (хи-квадрат тест). n=96.
Интересно е што додавањето на алкилни странични ланци подолги од C9 ја намали инхибиторната активност, што укажува дека соединенијата поврзани со кумамоичната киселина бараат странични ланци со одредена големина за да ја покажат својата биолошка активност.
Бидејќи анализата на односот структура-активност покажа дека C9 е модифициран во урсонска киселина, а нонилокси дериватот на урсонската киселина (во понатамошниот текст KAND 11) е најефикасниот инхибитор на растот на растенијата, спроведовме подетална карактеризација на KAND 11. Третманот на Arabidopsis со 50 μM KAND 11 речиси целосно го спречи ртењето, додека пониските концентрации (40, 30, 20 или 10 μM) на KAND 11 го инхибираа растот на коренот на начин зависен од дозата (Сл. 4a, b). За да тестираме дали KAND 11 влијае на одржливоста на коренскиот меристем, ги испитавме коренските меристеми обоени со пропидиум јодид (PI) и ја измеривме големината на површината на меристемот. Големината на меристемот на садници одгледувани на медиум што содржи 25 μM KAND-11 беше 151,1 ± 32,5 μm, додека големината на меристемот на садници одгледувани на контролен медиум што содржи DMSO беше 264,7 ± 30,8 μm (Сл. 4c, d), што укажува дека KAND-11 ја обновува клеточната активност. ширење. Коренски меристем. Во согласност со ова, третманот со KAND 11 ја намали количината на сигналот за маркер за клеточна делба CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS во коренскиот меристем (Сл. 4e) 17. Овие резултати укажуваат дека KAND 11 го инхибира растот на коренот со намалување на активноста на пролиферација на клетките.
Анализа на инхибиторниот ефект на дериватите на урбенонска киселина (урбенилокси деривати) врз растот. (а) 7-дневни садници од див тип Col одгледувани на MS плочи со наведените концентрации на KAND 11. Скала = 1 cm. (б) Квантификација на должината на коренот. Буквите означуваат значајни разлики (Tukey HSD тест, стр.< 0,05). n>16. Податоците се прикажани како средна вредност ± SD. (c) Конфокална микроскопија на корени од див тип Col обоени со пропидиум јодид, одгледувани на MS плочи со или без 25 μM KAND 11. Белите загради го означуваат меристемот на коренот. Скалната лента = 100 µm. (d) Квантификација на големината на меристемот на коренот (n = 10 до 11). Статистичките разлики се утврдени со користење на t-тест (p< 0,05). Лентите ја претставуваат просечната големина на меристемот. (e) Микроскопија со диференцијален интерферентен контраст (DIC) на коренски меристем што го содржи конструктот CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS обоен и обоен на 5-дневни садници одгледувани на MS плочи со или без 25 µM KAND тест.
Фитотоксичноста на KAND 11 беше дополнително тестирана со користење на друго дикотиледонско растение, тутун (Nicotiana tabacum) и главен модел организам на копнено растение, црн дроб (Marchantia polymorpha). Како и во случајот со Arabidopsis, садниците од тутун SR-1 одгледувани на медиум што содржи 25 μM KAND 11 произведоа пократки корења (Сл. 5а). Дополнително, 40 од 48 семиња 'ртеа на плочи што содржат 200 μM KAND 11, додека сите 48 семиња 'ртеа на лажно третирани медиуми, што укажува дека повисоките концентрации на KAND се значајни (p< 0,05; хи тест -квадрат) го инхибира 'ртењето на тутунот. (Сл. 5б). Покрај тоа, концентрацијата на KAND 11 што го инхибираше растот на бактериите во црниот дроб беше слична на ефективната концентрација во Arabidopsis (Сл. 5в). Овие резултати укажуваат дека KAND 11 може да го инхибира растот на различни растенија. Потоа ја испитавме можната цитотоксичност на соединенијата поврзани со мечкиниот моноамид кај други организми, имено човечките HeLa клетки и сојот Escherichia coli DH5α, како претставници на повисоки животински и бактериски клетки, соодветно. Во серија тестови за клеточна пролиферација, забележавме дека кумамонамид 1, кумамонамидна киселина 6 и KAND 11 не влијаеле на растот на HeLa или E. coli клетките при концентрации од 100 μM (Сл. 5д,е).
Инхибиција на растот на KAND 11 кај организми кои не се од Arabidopsis. (a) Две недели стари садници од тутун SR-1 од див тип беа одгледувани на вертикално поставени MS плочи што содржат 25 μM KAND 11. (b) Две недели стари садници од тутун SR-1 од див тип беа одгледувани на хоризонтално поставени MS плочи што содржат 200 μM KAND 11. (c) Две недели стари пупки од црн дроб Tak-1 од див тип одгледувани на Gamborg B5 плочи со наведените концентрации на KAND 11. Црвените стрелки означуваат спори кои престанале да растат во рамките на двонеделниот инкубационен период. (d) Тест за пролиферација на клетки на HeLa клетки. Бројот на одржливи клетки беше мерен во фиксни временски интервали со помош на комплет за броење клетки 8 (Dojindo). Како контрола, HeLa клетките беа третирани со 5 μg/ml актиномицин D (Act D), кој ја инхибира транскрипцијата на РНК полимеразата и предизвикува клеточна смрт. Анализите беа извршени во три примероци. (e) Тест за пролиферација на клетки на E. coli. Растот на E. coli беше анализиран со мерење на OD600. Како контрола, клетките беа третирани со 50 μg/ml ампицилин (Amp), кој ја инхибира синтезата на бактерискиот клеточен ѕид. Анализите беа извршени во три примероци.
За да го дешифрираме механизмот на дејство на цитотоксичноста предизвикана од соединенија поврзани со урамид, повторно ги анализиравме дериватите на урбенска киселина со умерени инхибиторни ефекти, како што е прикажано на сликата. Како што е прикажано на сликите 2б, 6а, садниците одгледувани на агар плочи што содржат високи концентрации (200 μM) урмотонска киселина 6 произведоа пократки и лево закривени корени (θ = – 23,7 ± 6,1), додека кај садниците одгледувани на контролната средина, садниците произведоа речиси прави корени (θ = – 3,8 ± 7,1). Познато е дека овој карактеристичен кос раст е резултат на дисфункција на кортикалните микротубули14,18. Во согласност со ова откритие, лековите што ги дестабилизираат микротубулите, дисопирамид и оризалин, предизвикаа слично навалување на коренот под нашите услови на раст (сл. 2б, 6а). Во исто време, тестиравме деривати на урмотонска киселина и одбравме неколку од нив кои, при одредени концентрации, предизвикаа кос раст на коренот. Соединенијата 8, 9 и 15 ја променија насоката на раст на коренот при 75 μM, 50 μM и 40 μM, соодветно, што укажува дека овие соединенија можат ефикасно да ги дестабилизираат микротубулите (Сл. 2б, 6а). Исто така, го тестиравме најмоќниот дериват на урсолна киселина, KAND 11, при пониска концентрација (15 μM) и откривме дека примената на KAND 11 го инхибира растот на коренот и дека насоката на раст на коренот е нерамномерна, иако тие имаат тенденција да се наклонуваат налево (Слика C3). Бидејќи повисоките концентрации на лекови што ги дестабилизираат микротубулите понекогаш го инхибираат растот на растенијата, наместо да предизвикуваат навалување на коренот, последователно ја проценивме можноста KAND 11 да влијае на микротубулите со набљудување на кортикалните микротубули во епидермалните клетки на коренот. Имунохистохемијата со употреба на антитела против β-тубулин во епидермалните клетки на корените на расадот третирани со 25 μM KAND 11 покажа исчезнување на речиси сите кортикални микротубули во епидермалните клетки во зоната на елонгација (Сл. 6б). Овие резултати укажуваат дека кумамотонската киселина и нејзините деривати дејствуваат директно или индиректно на микротубулите за да ги нарушат и дека овие соединенија се нови инхибитори на микротубулите.
Урсонската киселина и нејзините деривати ги менуваат кортикалните микротубули кај Arabidopsis thaliana. (a) Агол на наклон на коренот мерен во присуство на различни деривати на урмотонска киселина при наведените концентрации. Анализирани се и ефектите на две соединенија за кои е познато дека ги инхибираат микротубулите: дисопирамид и оризалин. Вметнатата слика го прикажува стандардот што се користи за мерење на аголот на раст на коренот. Ѕвездичките означуваат значајни разлики со лажниот третман (t тест, p< 0,05). n>19. Скала = 1 см. (б) Кортикални микротубули во епидермални клетки во зоната на издолжување. Микротубулите во корените на Arabidopsis Col од див тип одгледувани на MS плочи со или без 25 μM KAND 11 беа визуелизирани со имунохистохемиско боење со употреба на β-тубулински примарни антитела и Alexa Fluor-конјугирани секундарни антитела. Скала = 10 µm. (в) Митотична структура на микротубулите во коренскиот меристем. Микротубулите беа визуелизирани со употреба на имунохистохемиско боење. Митотичките структури, вклучувајќи ги профилазните зони, вретената и фрагмопластите, беа изброени од конфокални слики. Стрелките означуваат митотични структури на микротубули. Ѕвездичките означуваат значајни разлики со лажен третман (t тест, p< 0,05). n>9. Ширина на скалата = 50 µm.
Иако Урса има способност да ја наруши функцијата на микротубулите, се очекува нејзиниот механизам на дејство да биде различен од типичните агенси за деполимеризација на микротубулите. На пример, повисоките концентрации на агенси за деполимеризација на микротубулите, како што се дисопирамид и оризалин, индуцираат анизотропно ширење на епидермалните клетки, додека KAND 11 не го прави тоа. Покрај тоа, ко-апликацијата на KAND 11 и дисопирамид резултираше со комбиниран одговор на раст на коренот предизвикан од дизопирамид и беше забележана инхибиција на растот предизвикан од KAND 11 (Сл. S4). Исто така, го анализиравме одговорот на преосетливиот мутант на дизопирамид 1-1 (phs1-1) на KAND 11. phs1-1 има неканонска точкеста мутација на тубулин киназа и произведува пократки корени кога се третира со дисопирамид9,20. Садниците од мутант phs1-1 одгледувани на агарска средина што содржи KAND 11 имаа пократки корени слични на оние одгледувани на дизопирамид (сл. S5).
Покрај тоа, забележавме митотични структури на микротубули, како што се профилазни зони, вретена и фрагмопласти, во коренскиот меристем на садници третирани со KAND 11. Во согласност со набљудувањата за CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, беше забележано значително намалување на бројот на митотични микротубули (Сл. 6c).
За да ја карактеризираме цитотоксичноста на KAND 11 при субцелуларна резолуција, ги третиравме клетките од суспензија на тутун BY-2 со KAND 11 и го набљудувавме нивниот одговор. Прво додадовме KAND 11 на клетките BY-2 што го експресираат TagRFP-TUA6, кој флуоресцентно ги означува микротубулите, за да го процениме ефектот на KAND 11 врз кортикалните микротубули. Густината на кортикалните микротубули беше оценета со помош на анализа на слика, која го квантификуваше процентот на цитоскелетни пиксели меѓу цитоплазматските пиксели. Резултатите од анализата покажаа дека по третманот со 50 μM или 100 μM KAND 11 во тек на 1 час, густината значително се намали на 0,94 ± 0,74% или 0,23 ± 0,28%, соодветно, додека густината на клетките третирани со DMSO изнесуваше 1,61 ± 0,34% (Сл. 7a). Овие резултати се во согласност со набљудувањето кај Arabidopsis дека третманот со KAND 11 индуцира деполимеризација на кортикалните микротубули (Сл. 6b). Исто така, ја испитавме линијата BY-2 со GFP-ABD-обележани актински филаменти по третман со иста концентрација на KAND 11 и забележавме дека третманот со KAND 11 ги наруши актинските филаменти. Третманот со 50 μM или 100 μM KAND 11 во текот на 1 час значително ја намали густината на актинските филаменти на 1,20 ± 0,62% или 0,61 ± 0,26%, соодветно, додека густината во клетките третирани со DMSO беше 1,69 ± 0,51% (Сл. 2). 7б). Овие резултати се во спротивност со ефектите на пропизамид, кој не влијае на актинските филаменти, и латрункулин Б, актински деполимеризер кој не влијае на микротубулите (SI Слика S6). Покрај тоа, третманот со кумамонамид 1, кумамонамидна киселина 6 или KAND 11 не влијаеше на микротубулите во HeLa клетките (SI Слика S7). Според тоа, се верува дека механизмот на дејство на KAND 11 е различен од оној на познатите нарушувачи на цитоскелетот. Покрај тоа, нашето микроскопско набљудување на BY-2 клетки третирани со KAND 11 откри почеток на клеточна смрт за време на третманот со KAND 11 и покажа дека процентот на мртви клетки обоени во сино со Evans не се зголемил значително по 30 минути третман со KAND 11, додека по 90 минути третман со 50 μM или 100 μM KAND, бројот на мртви клетки се зголемил на 43,7% или 80,1%, соодветно (Сл. 7в). Земени заедно, овие податоци укажуваат дека новиот дериват на урсолна киселина KAND 11 е специфичен за растенијата цитоскелетен инхибитор со претходно непознат механизам на дејство.
KAND влијае на кортикалните микротубули, актинските филаменти и одржливоста на клетките BY-2 од тутунот. (а) Визуелизација на кортикалните микротубули во клетките BY-2 во присуство на TagRFP-TUA6. BY-2 клетките третирани со KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO беа испитани со конфокална микроскопија. Густината на кортикалните микротубули беше пресметана од микрографии на 25 независни клетки. Буквите означуваат значајни разлики (Tukey HSD тест, стр.< 0,05). Скала = 10 µm. (б) Кортикални актински филаменти во BY-2 клетки визуелизирани во присуство на GFP-ABD2. BY-2 клетките третирани со KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO беа испитани со конфокална микроскопија. Густината на кортикалните актински филаменти беше пресметана од микрографии на 25 независни клетки. Буквите означуваат значајни разлики (Tukey HSD тест, стр.< 0,05). Скала = 10 µm. (c) Набљудување на мртви BY-2 клетки со боење со Evans blue. BY-2 клетките третирани со KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO беа испитани со микроскопија со светло поле. n=3. Скала = 100 µm.
Откривањето и примената на нови природни производи доведе до значителен напредок во различни аспекти на човечкиот живот, вклучувајќи ја медицината и земјоделството. Спроведени се историски истражувања за добивање корисни соединенија од природни ресурси. Особено, актиномицетите се познати како корисни како антипаразитски антибиотици за нематоди поради нивната способност да произведуваат разни секундарни метаболити како што се авермектин, водечко соединение на ивермектин и блеомицин и неговите деривати, кои се користат медицински како антиканцерогено средство21,22. Исто така, од актиномицетите се откриени различни хербицидни соединенија, од кои некои веќе се користат комерцијално1,23. Затоа, анализата на метаболитите на актиномицетите за изолирање на природни производи со посакувани биолошки активности се смета за ефикасна стратегија. Во оваа студија, откривме ново соединение, кумамонамид, од S. werraensis и успешно го синтетизиравме. Урсонската киселина е синтетички меѓупроизвод на урбенамид и неговите деривати. Може да предизвика карактеристично свиткување на коренот, да покаже умерена до силна хербицидна активност и директно или индиректно да ги оштети растителните микротубули. Сепак, механизмот на дејство на урмотонската киселина може да се разликува од оној на постојните инхибитори на микротубулите, бидејќи KAND 11, исто така, ги нарушува актинските филаменти и предизвикува клеточна смрт, што укажува на регулаторен механизам преку кој урмотонската киселина и нејзините деривати влијаат на широк спектар на цитоскелетни структури.
Понатамошната детална карактеризација на урбенонската киселина ќе помогне подобро да се разбере механизмот на дејство на урбенонската киселина. Поточно, следната цел е да се процени способноста на урсонската киселина да се врзува за редуцирани микротубули за да се утврди дали урсонската киселина и нејзините деривати дејствуваат директно на микротубулите и ги деполимеризираат, или дали нивното дејство резултира со дестабилизација на микротубулите. Покрај тоа, во случај кога микротубулите не се директна цел, идентификувањето на местото на дејство и молекуларните цели на урсонската киселина на растителните клетки ќе помогне понатамошно разбирање на својствата на сродните соединенија и можните начини за подобрување на хербицидната активност. Нашиот тест за биоактивност ја откри единствената цитотоксична способност на урсонската киселина врз растот на растенија како што се Arabidopsis thaliana, тутун и црн дроб, додека ниту E. coli ниту HeLa клетките не беа засегнати. Мала или никаква токсичност за животинските клетки е предност на дериватите на урсонската киселина ако се развијат како хербициди за употреба на отворени земјоделски полиња. Всушност, бидејќи микротубулите се вообичаени структури кај еукариотите, нивната селективна инхибиција во растенијата е клучен услов за хербицидите. На пример, пропизамид, средство за деполимеризација на микротубули кое директно се врзува за тубулин и ја инхибира полимеризацијата, се користи како хербицид поради неговата ниска токсичност за животинските клетки24. За разлика од дисопирамидот, сродните бензамиди имаат различни специфичности на целта. Покрај растителните микротубули, RH-4032 или бензоксамид, исто така, ги инхибираат микротубулите на животинските клетки или оомицетите, соодветно, а залиламидот се користи како фунгицид поради неговата ниска фитотоксичност25,26,27. Новооткриената мечка и неговите деривати покажуваат селективна цитотоксичност против растенијата, но вреди да се напомене дека понатамошните модификации можат да ја променат нивната специфичност на целта, потенцијално обезбедувајќи дополнителни деривати за контрола на патогени габи или оомицети.
Уникатните својства на урбенонската киселина и нејзините деривати се корисни за нивниот развој како хербициди и употреба како алатки за истражување. Важноста на цитоскелетот во контролирањето на обликот на растителните клетки е широко призната. Поранешните студии покажаа дека растенијата развиле сложени механизми на организација на кортикалните микротубули преку контролирање на динамиката на микротубулите за правилно контролирање на морфогенезата. Идентификувани се голем број молекули одговорни за регулирање на активноста на микротубулите, а поврзаните истражувања се сè уште во тек3,4,28. Нашето сегашно разбирање на динамиката на микротубулите во растителните клетки не ги објаснува целосно механизмите на организација на кортикалните микротубули. На пример, иако и дисопирамидот и оризалинот можат да ги деполимеризираат микротубулите, дисопирамидот предизвикува сериозно нарушување на коренот, додека оризалинот има релативно благ ефект. Покрај тоа, мутациите во тубулинот, кој ги стабилизира микротубулите, исто така предизвикуваат декстроротација во корените, додека паклитакселот, кој исто така ја стабилизира динамиката на микротубулите, не го прави тоа. Затоа, проучувањето и идентификувањето на молекуларните цели на урсолната киселина треба да обезбеди нови сознанија за регулирањето на кортикалните микротубули на растенијата. Исто така, идните споредби на хемикалии кои се ефикасни во поттикнувањето на нарушен раст, како што е дисопирамидот, и помалку ефикасни хемикалии, како што се оризалин или кумамоторична киселина, ќе дадат индиции за тоа како се случува нарушениот раст.
Од друга страна, одбранбените цитоскелетни преуредувања се уште една можност за објаснување на цитотоксичноста на урсонската киселина. Инфекцијата со патоген или воведувањето на еликтор во растителните клетки понекогаш предизвикува уништување на цитоскелетот и последователна клеточна смрт29. На пример, објавено е дека криптоксантин добиен од оомицети ги нарушува микротубулите и актинските филаменти пред смртта на клетките на тутунот, слично на она што се случува со третманот со KAND30,31. Сличностите помеѓу одбранбените одговори и клеточните одговори предизвикани од урсонската киселина нè доведоа до хипотеза дека тие предизвикуваат вообичаени клеточни процеси, иако е очигледен побрз и посилен ефект на урсонската киселина од криптоксантинот. Сепак, студиите покажаа дека нарушувањето на актинските филаменти ја промовира спонтана клеточна смрт, што не е секогаш придружено со нарушување на микротубулите29. Покрај тоа, останува да се види дали патогенот или еликторот предизвикуваат нарушен раст на коренот, како што прават дериватите на урсонската киселина. Така, молекуларното знаење што ги поврзува одбранбените одговори и цитоскелетот е привлечен проблем што треба да се реши. Со искористување на присуството на соединенија со ниска молекуларна тежина поврзани со урсонската киселина, како и низа деривати со различна јачина, тие можат да обезбедат можности за таргетирање на непознати клеточни механизми.
Земени заедно, откривањето и примената на нови соединенија кои ја модулираат динамиката на микротубулите ќе обезбедат моќни методи за справување со сложените молекуларни механизми што лежат во основата на одредувањето на обликот на растителните клетки. Во овој контекст, неодамна развиеното соединение урмотонска киселина, кое влијае на микротубулите и актинските филаменти и предизвикува клеточна смрт, може да даде можност за дешифрирање на врската помеѓу контролата на микротубулите и овие други механизми. Така, хемиската и биолошката анализа со употреба на урбенонска киселина ќе ни помогне да ги разбереме молекуларните регулаторни механизми што го контролираат цитоскелетот на растенијата.
Инокулирајте го S. werraensis MK493-CF1 во Ерленмаерова колба со преграда од 500 mL што содржи 110 mL семенска подлога што се состои од 2% (w/v) галактоза, 2% (w/v) есенцијална паста, 1% (w/v) состав на Bacto. -сојтон (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) екстракт од пченка (KOGOSTCH Co., Ltd., Јапонија), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 и 0,2% CaCO3 во дејонизирана вода. (pH 7,4 пред стерилизација). Семенските култури беа инкубирани на ротационен шејкер (180 вртежи во минута) на 27°C во тек на 2 дена. Производствено култивирање преку ферментација во цврста состојба. Семенската култура (7 ml) беше префрлена во колба K-1 од 500 ml што содржеше 40 g производствен медиум што се состоеше од 15 g пресуван јачмен (MUSO Co., Ltd., Јапонија) и 25 g дејонизирана вода (pH вредноста не беше прилагодена пред стерилизација). Ферментацијата беше спроведена на 30°C во темница 14 дена. Материјалот за ферментација беше екстрахиран со 40 ml/шише EtOH и центрифугиран (1500 g, 4°C, 10 мин). Супернатантот на културата (60 ml) беше екстрахиран со мешавина од 10% MeOH/EtOAc. Органскиот слој беше испарен под намален притисок за да се добие остаток (59,5 mg), кој беше подложен на HPLC со градиентно елуирање (0–10 минути: 90%) на колона со обратна фаза (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × должина 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 минути: 90% H2O/CH3CN до 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минути: 90% H2O/EtOH, 45–155 минути: 90% H2O/EtOH до 100% EtOH (градиент (градиент), 155–200 мин: 100% EtOH) со брзина на проток од 1,5 ml/мин, кумамонамид (1, 36,0 mg) беше изолиран како бел аморфен прав.
Кумамотоамид(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ пресметана вредност: 141,0659, измерена вредност: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Семињата од Колумбија (Col-0) беа добиени од Центарот за биолошки ресурси Arabidopsis (ABRC) со дозвола за истражувачка употреба. Семињата Col-0 беа размножени и одржувани во наши лабораториски услови и користени како растенија од див тип Arabidopsis. Семињата од Arabidopsis беа површински стерилизирани и култивирани во медиум од полујачина Murashige и Skoog што содржи 2% сахароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-морфолино)етансулфонска киселина (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) и 1,5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, на 23 °C и константна светлина. Семињата од мутантот phs1-1 беа обезбедени од Т. Хашимото (Нара Institute of Science and Technology).
Семињата од сојот SR-1 беа обезбедени од Т. Хашимото (Институт за наука и технологија Нара) и беа користени како растенија од тутун од див тип. Семето од тутун беше површински стерилизирано и потопено во стерилна вода три ноќи за да се поттикне 'ртење, потоа ставено во раствор со половина концентрација што содржи 2% сахароза, 0,05% (w/v) MES и 0,8% желатинозна гума (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. и Skoog медиум) со pH 5,7 и инкубирано на 23°C под постојано осветлување.
Сојот Tak-1 го обезбеди Т. Кохчи (Универзитет во Кјото) и беше користен како стандардна експериментална единица за студијата за црн дроб. Gemma беше добиен од стерилизирани култивирани растенија, а потоа положен на Gamborg B5 медиум (Fujifilm Wako Pure Chemical) што содржи 1% сахароза и 0,3% желатинозна гума и инкубиран на 23°C под континуирано светло.
Клетките од тутун BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) беа обезбедени од С. Хасезава (Универзитет во Токио). BY-2 клетките беа разредени 95 пати во модифицирана Linsmeier и Skoog средна средина и дополнети неделно со 2,4-дихлорофеноксиоцетна киселина 32. Суспензијата на клетките беше измешана на ротационен шејкер на 130 вртежи во минута на 27°C во темница. Измијте ги клетките со 10 пати поголем волумен од свежата средна средина и ресуспендирајте ги во истата средна средина. Трансгените клеточни линии BY-2 кои стабилно го експресираат маркерот на микротубулите TagRFP-TUA6 или маркерот на актинските филаменти GFP-ABD2 под промоторот на мозаичниот вирус на карфиол 35S беа генерирани како што е опишано33,34,35. Овие клеточни линии може да се одржуваат и синхронизираат со користење на процедури слични на оние што се користат за оригиналната клеточна линија BY-2.
HeLa клетките беа култивирани во модифициран Eagle-ов медиум на Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) дополнет со 10% фетален говедски серум, 1,2 U/ml пеницилин и 1,2 μg/ml стрептомицин во инкубатор на 37°C со 5% CO2.
Сите експерименти опишани во овој ракопис беа извршени во согласност со јапонските прописи и упатства за биолошка безбедност.
Соединенијата беа растворени во диметил сулфоксид (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) како основни раствори и разредени во MS медиум за Arabidopsis и тутун или Gamborg B5 медиум за црн дроб. За тестот за инхибиција на растот на коренот, повеќе од 10 семиња по плоча беа посеани на агар медиум што ги содржи наведените соединенија или DMSO. Семињата беа инкубирани во комора за раст 7 дена. Садниците беа фотографирани и беше измерена должината на корените. За тестот за ртење на Arabidopsis, 48 семиња по плоча беа посеани на агар медиум што содржи 200 μM соединение или DMSO. Семињата од Arabidopsis беа одгледувани во комора за раст и бројот на 'ртени садници беше изброен 7 дена по ртењето (dag). За тестот за ртење на тутун, 24 семиња по плоча беа посеани на агар медиум што содржи 200 μM KAND или DMSO. Семињата од тутун беа одгледувани во комора за раст и бројот на 'ртени садници беше изброен по 14 дена. За тестот за инхибиција на растот на црниот дроб, 9 ембриони од секоја плоча беа положени на агарска средина што ги содржи наведените концентрации на KAND или DMSO и инкубирани во комора за раст 14 дена.
За визуелизација на организацијата на коренскиот меристем, користете садници обоени со 5 mg/ml пропидиум јодид (PI). PI сигналите беа набљудувани со флуоресцентна микроскопија со употреба на конфокален ласерски скенирачки микроскоп TCS SPE (Leica Microsystems).
Хистохемиското боење на корените со β-глукуронидаза (GUS) беше извршено според протоколот опишан од Малами и Бенфеј36. Садниците беа фиксирани во 90% ацетон преку ноќ, обоени со 0,5 mg/ml 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-d-глукуронска киселина во GUS пуфер 1 час и ставени во раствор на хидриран хлоралдехид (8 g хлорал хидрат, 2 ml вода и 1 ml глицерол) и набљудувани со диференцијална интерферентна контрастна микроскопија со помош на микроскоп Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Аглите на коренот беа измерени на садници стари 7 дена одгледувани на вертикално поставени плочи. Измерете го аголот на коренот од насоката на гравитациониот вектор како што е опишано во чекор 6.
Распоредот на кортикалните микротубули беше забележан како што е опишано, со мали модификации на протоколот 37. Антитело против β-тубулин (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) и анти-глувчешки IgG конјугиран со Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) беа користени како примарни и секундарни антитела во разредувања од 1:1000 и 1:100, соодветно. Флуоресцентните слики беа добиени со помош на конфокален ласерски скенирачки микроскоп TCS SPE (Leica Microsystems). Снимете Z-стек слики и креирајте проекции со максимален интензитет според упатствата на производителот.
Тестот за пролиферација на клетките HeLa беше извршен со користење на комплетот за броење клетки 8 (Dojindo) според упатствата на производителот.
Растот на E. coli DH5α беше анализиран со мерење на густината на клетките во култура со помош на спектрофотометар на 600 nm (OD600).
Цитоскелетната организација кај трансгените BY-2 клетки беше набљудувана со помош на флуоресцентен микроскоп опремен со конфокален уред за скенирање CSU-X1 (Yokogawa) и sCMOS камера (Zyla, Andor Technology). Густината на цитоскелетот беше оценета со анализа на слика, која го квантифицираше процентот на цитоскелетни пиксели меѓу цитоплазматските пиксели во конфокалните слики со помош на софтверот ImageJ како што е опишано38,39.
За да се открие клеточна смрт кај BY-2 клетките, аликвот од клеточната суспензија беше инкубиран со 0,05% Evans blue во тек на 10 минути на собна температура. Селективното боење на мртвите клетки со Evans blue зависи од екструзијата на бојата од одржливите клетки од страна на интактната плазма мембрана40. Обоените клетки беа набљудувани со помош на микроскоп со светло поле (BX53, Olympus).
HeLa клетките беа одгледувани во DMEM дополнет со 10% FBS во навлажнет инкубатор на 37°C и 5% CO2. Клетките беа третирани со 100 μM KAND 11, кумамонамична киселина 6, кумамонамид 1, 100 ng/ml колцемид (Gibco) или 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) во тек на 6 часа на 37°C. Клетките беа фиксирани со MetOH 10 минути, а потоа со ацетат 5 минути на собна температура. Фиксираните клетки беа инкубирани со примарно антитело β-тубулин (1D4A4, Proteintech: 66240-1) разредено во 0,5% BSA/PBS во тек на 2 часа, измиени 3 пати со TBST, а потоа инкубирани со козјо антитело Alexa Fluor. 488 1 час. – Глувчешки IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) и 15 ng/ml 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) разреден во 0,5% BSA/PBS. По трикратно миење со TBST, обоените клетки беа набљудувани на инвертиран микроскоп Nikon Eclipse Ti-E. Сликите беа направени со оладена Hamamatsu ORCA-R2 CCD камера со користење на софтверот MetaMorph (Molecular Devices).
Време на објавување: 17 јуни 2024 година