inquirybg

Евалуација на јод и авермектин како индуктори на нематодна болест кај бор

Боровата нематода е карантински миграциски ендопаразит за кој е познато дека предизвикува сериозни економски загуби во екосистемите на боровите шуми. Во оваа студија се разгледува нематицидната активност на халогенираните индоли против боровите нематоди и нивниот механизам на дејство. Нематицидните активности на 5-јодоиндолот и авермектинот (позитивна контрола) против боровите нематоди беа слични и високи при ниски концентрации (10 μg/mL). 5-јодоиндолот ја намали плодноста, репродуктивната активност, ембрионалната и ларвалната смртност и локомоторното однесување. Молекуларните интеракции на лигандите со специфичните за безрбетниците рецептори на хлориден канал контролирани од глутамат ја поддржуваат идејата дека 5-јодоиндолот, како и авермектинот, цврсто се врзува за активното место на рецепторот. 5-јодоиндолот, исто така, предизвика различни фенотипски деформации кај нематодите, вклучувајќи абнормален колапс/смалување на органите и зголемена вакуолизација. Овие резултати сугерираат дека вакуолите можат да играат улога во смртта посредувана од метилација на нематодите. Важно е да се напомене дека 5-јодоиндолот не бил токсичен за двата растителни вида (зелка и ротквица). Така, оваа студија покажува дека примената на јодоиндол под услови на животната средина може да го контролира оштетувањето од венење на борот.
Боровата нематода (Bursaphelenchus xylophilus) припаѓа на боровите нематоди (PWN), миграциски ендопаразитски нематоди за кои е познато дека предизвикуваат сериозна еколошка штета на екосистемите на боровите шуми1. Болеста на венењето на боровите шуми (PWD) предизвикана од боровата нематода станува сериозен проблем на неколку континенти, вклучувајќи ги Азија и Европа, а во Северна Америка, нематодата ги уништува интродуцираните видови бор1,2. Опаѓањето на бројот на борови дрвја е голем економски проблем, а изгледите за негово глобално ширење се загрижувачки3. Следните видови борови најчесто се напаѓани од нематодата: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii и Pinus radiata4. Боровата нематода е сериозна болест која може да ги убие боровите дрвја во рок од неколку недели или месеци од инфекцијата. Покрај тоа, епидемиите на борови нематоди се чести во различни екосистеми, па затоа се воспоставени перзистентни синџири на инфекција1.
Bursaphelenchus xylophilus е карантинска растителна-паразитна нематода која припаѓа на натсемејството Aphelenchoidea и кладот ​​102.5. Нематодата се храни со габи и се размножува во дрвените ткива на боровите дрвја, развивајќи се во четири различни ларвални фази: L1, L2, L3, L4 и возрасна единка1,6. Во услови на недостаток на храна, боровата нематода преминува во специјализирана ларвална фаза - дауер, која паразитира кај својот вектор - боровата кораста (Monochamus alternatus) и се пренесува на здрави борови дрвја. Кај здрави домаќини, нематодите брзо мигрираат низ растителните ткива и се хранат со паренхиматозни клетки, што доведува до голем број реакции на преосетливост, венење на борот и смрт во рок од една година по инфекцијата1,7,8.
Биолошката контрола на боровите нематоди долго време претставува предизвик, а мерките за карантин датираат од 20 век. Сегашните стратегии за контрола на боровите нематоди првенствено вклучуваат хемиски третмани, вклучувајќи фумигација на дрво и имплантација на нематициди во стеблата на дрвјата. Најчесто користените нематициди се авермектин и авермектин бензоат, кои припаѓаат на семејството авермектини. Овие скапи хемикалии се многу ефикасни против многу видови нематоди и се сметаат за еколошки безбедни9. Сепак, се очекува повторната употреба на овие нематициди да создаде притисок за селекција што речиси сигурно ќе доведе до појава на отпорни борови нематоди, како што е покажано за неколку штетници од инсекти, како што се Leptinotarsa ​​decemlineata, Plutella xylostella и нематодите Trichostrongylus colubriformis и Ostertagia circumcincta, кои постепено развиле отпорност на авермектините10,11,12. Затоа, моделите на отпорност треба редовно да се изучуваат, а нематицидите континуирано да се проверуваат за да се пронајдат алтернативни, економични и еколошки мерки за контрола на PVD. Во последните децении, голем број автори предложија употреба на растителни екстракти, есенцијални масла и испарливи материи како агенси за контрола на нематоди13,14,15,16.
Неодамна ја демонстриравме нематоцидната активност на индолот, молекул што сигнализира меѓуклеточно и меѓукралства, кај Caenorhabditis elegans 17. Индолот е широко распространет интрацелуларен сигнал во микробната екологија, контролирајќи бројни функции што влијаат на микробната физиологија, формирањето на спори, стабилноста на плазмидите, отпорноста на лекови, формирањето на биофилм и вирулентноста 18, 19. Активноста на индолот и неговите деривати против други патогени нематоди не е проучена. Во оваа студија, ја испитавме нематоцидната активност на 34 индоли против борови нематоди и го разјаснивме механизмот на дејство на најмоќниот 5-јодоиндол користејќи микроскопија, фотографирање со временско запирање и експерименти со молекуларно докирање, и ги проценивме неговите токсични ефекти врз растенијата користејќи тест за 'ртење на семе.
Претходно е објавено дека високи концентрации (>1,0 mM) на индол имаат нематоцидно дејство врз нематодите17. По третманот на B. xylophilus (мешани животни фази) со индол или 33 различни деривати на индол на 1 mM, смртноста на B. xylophilus беше измерена со броење на живи и мртви нематоди во контролната и третираната група. Пет индоли покажаа значајна нематоцидна активност; преживувањето на нетретирана контролна група беше 95 ± 7% по 24 часа. Од тестираните 34 индоли, 5-јодоиндол и 4-флуороиндол на 1 mM предизвикаа 100% смртност, додека 5,6-дифлуороиндиго, метилиндол-7-карбоксилат и 7-јодоиндол предизвикаа приближно 50% смртност (Табела 1).
Влијание на 5-јодоиндол врз формирањето на вакуоли и метаболизмот на нематодата од бор. (A) Влијание на авермектин и 5-јодоиндол врз возрасни машки нематоди, (B) јајца од нематоди во стадиум L1 и (C) метаболизам на B. xylophilus, (i) не беа забележани вакуоли на 0 часа, третманот резултираше со (ii) вакуоли, (iii) акумулација на повеќе вакуоли, (iv) отекување на вакуоли, (v) фузија на вакуоли и (vi) формирање на џиновски вакуоли. Црвените стрелки означуваат отекување на вакуоли, сините стрелки означуваат фузија на вакуоли, а црните стрелки означуваат џиновски вакуоли. Скала = 50 μm.
Покрај тоа, оваа студија го опиша и секвенцијалниот процес на смрт предизвикана од метан кај боровите нематоди (Слика 4C). Метаногената смрт е неапоптотски тип на клеточна смрт поврзана со акумулација на истакнати цитоплазматски вакуоли27. Морфолошките дефекти забележани кај боровите нематоди се чини дека се тесно поврзани со механизмот на смрт предизвикана од метан. Микроскопското испитување во различни периоди покажа дека гигантските вакуоли се формирале по 20 часа изложеност на 5-јодоиндол (0,1 mM). Микроскопските вакуоли биле забележани по 8 часа третман, а нивниот број се зголемил по 12 часа. Неколку големи вакуоли биле забележани по 14 часа. Неколку споени вакуоли биле јасно видливи по 12-16 часа третман, што укажува дека фузијата на вакуоли е основа на метаногениот механизам на смрт. По 20 часа, низ целиот црв биле пронајдени неколку гигантски вакуоли. Овие набљудувања претставуваат прв извештај за метуоза кај C. elegans.
Кај црвите третирани со 5-јодоиндол, забележана е и агрегација и руптура на вакуолите (сл. 5), што се потврдува со свиткување на црвот и ослободување на вакуолите во околината. Нарушување на вакуолите е забележано и во мембраната на лушпата од јајцето, која нормално е зачувана недопрена од L2 за време на испилувањето (Дополнителна слика S2). Овие набљудувања ја поддржуваат вклученоста на акумулацијата на течности и осморегулаторната инсуфициенција, како и реверзибилното оштетување на клетките (RCI), во процесот на формирање и гноење на вакуолите (сл. 5).
Хипотезирајќи ја улогата на јодот во набљудуваното формирање на вакуоли, ја испитавме нематицидната активност на натриум јодид (NaI) и калиум јодид (KI). Сепак, при концентрации (0,1, 0,5 или 1 mM), тие не влијаеја ниту на преживувањето на нематодите ниту на формирањето на вакуоли (Дополнителна слика S5), иако 1 mM KI имаше мало нематицидно дејство. Од друга страна, 7-јодоиндолот (1 или 2 mM), како и 5-јодоиндолот, предизвика повеќекратни вакуоли и структурни деформации (Дополнителна слика S6). Двата јодоиндоли покажаа слични фенотипски карактеристики кај боровите нематоди, додека NaI и KI не. Интересно е што индолот не предизвика формирање на вакуоли кај B. xylophilus при тестираните концентрации (податоците не се прикажани). Така, резултатите потврдија дека комплексот индол-јод е одговорен за вакуолизацијата и метаболизмот на B. xylophilus.
Меѓу индолите тестирани за нематицидна активност, 5-јодоиндолот имал највисок индекс на лизгање од -5,89 kcal/mol, проследен од 7-јодоиндол (-4,48 kcal/mol), 4-флуороиндол (-4,33) и индол (-4,03) (Слика 6). Силната водородна врска на 5-јодоиндолот со леуцин 218 го стабилизира неговото врзување, додека сите други деривати на индол се врзуваат за серин 260 преку водородни врски на страничниот ланец. Меѓу другите моделирани јодоиндоли, 2-јодоиндолот има вредност на врзување од -5,248 kcal/mol, што се должи на неговата главна водородна врска со леуцин 218. Други познати врзувања вклучуваат 3-јодоиндол (-4,3 kcal/mol), 4-јодоиндол (-4,0 kcal/mol) и 6-флуороиндол (-2,6 kcal/mol) (Дополнителна слика S8). Повеќето халогенирани индоли и самиот индол, со исклучок на 5-јодоиндол и 2-јодоиндол, формираат врска со серин 260. Фактот дека водородното поврзување со леуцин 218 е показател за ефикасно врзување рецептор-лиганд, како што е забележано кај ивермектинот (Дополнителна слика S7), потврдува дека 5-јодоиндолот и 2-јодоиндолот, како и ивермектинот, се врзуваат цврсто за активното место на GluCL рецепторот преку леуцин 218 (Слика 6 и Дополнителна слика S8). Претпоставуваме дека ова врзување е потребно за да се одржи структурата на отворени пори на GluCL комплексот и дека со цврсто врзување за активното место на GluCL рецепторот, 5-јодоиндолот, 2-јодоиндолот, авермектинот и ивермектинот на тој начин го одржуваат јонскиот канал отворен и овозможуваат апсорпција на течности.
Молекуларно поврзување на индол и халогениран индол со GluCL. Ориентации на врзување на лигандите (A) индол, (B) 4-флуороиндол, (C) 7-јодоиндол и (D) 5-јодоиндол за активното место на GluCL. Протеинот е претставен со лента, а водородните врски на 'рбетот се прикажани како жолти испрекинати линии. (A'), (B'), (C') и (D') ги покажуваат интеракциите на соодветните лиганди со околните аминокиселински остатоци, а водородните врски на страничниот ланец се означени со розови испрекинати стрелки.
Беа спроведени експерименти за да се процени токсичниот ефект на 5-јодоиндолот врз 'ртењето на семето од зелка и ротквица. 5-јодоиндолот (0,05 или 0,1 mM) или авермектинот (10 μg/mL) имаа мал или никаков ефект врз почетното 'ртење и никнување на растенијата (Слика 7). Покрај тоа, не е пронајдена значајна разлика помеѓу стапката на 'ртење на нетретираните контроли и семето третирано со 5-јодоиндол или авермектин. Ефектот врз издолжувањето на коренот и бројот на формирани странични корени беше незначителен, иако 1 mM (10 пати поголема од неговата активна концентрација) 5-јодоиндол малку го одложи развојот на страничните корени. Овие резултати укажуваат дека 5-јодоиндолот е нетоксичен за растителните клетки и не се меша во процесите на развој на растенијата при проучуваните концентрации.
Влијание на 5-јодоиндолот врз 'ртењето на семето. 'Ртење, никнување и странично вкоренување на семето од B. oleracea и R. raphanistrum на агарска подлога од Murashige и Skoog со или без авермектин или 5-јодоиндол. 'Ртењето е забележано по 3 дена инкубација на 22°C.
Оваа студија известува за неколку случаи на убивање на нематоди од страна на индоли. Важно е да се напомене дека ова е прв извештај за метилација предизвикана од јодоиндол (процес предизвикан од акумулација на мали вакуоли кои постепено се спојуваат во џиновски вакуоли, што на крајот доведува до руптура и смрт на мембраната) во борови иглички, при што јодоиндолот покажува значајни нематицидни својства слични на оние на комерцијалниот нематицид авермектин.
Претходно е објавено дека индолите вршат повеќекратни сигнални функции кај прокариотите и еукариотите, вклучувајќи инхибиција/формирање на биофилм, преживување на бактерии и патогеност19,32,33,34. Неодамна, потенцијалните терапевтски ефекти на халогенираните индоли, индолните алкалоиди и полусинтетските деривати на индол привлекоа широк истражувачки интерес35,36,37. На пример, покажано е дека халогенираните индоли ги убиваат перзистентните клетки на Escherichia coli и Staphylococcus aureus37. Покрај тоа, од научен интерес е да се проучи ефикасноста на халогенираните индоли против други видови, родови и кралства, а оваа студија е чекор кон постигнување на оваа цел.
Тука, ние предлагаме механизам за леталност предизвикана од 5-јодоиндол кај C. elegans, базиран на реверзибилно оштетување на клетките (RCI) и метилација (Слики 4C и 5). Едематозните промени како што се оток и вакуоларна дегенерација се индикатори за RCI и метилација, кои се манифестираат како џиновски вакуоли во цитоплазмата48,49. RCI се меша во производството на енергија со намалување на производството на ATP, предизвикувајќи дефект на ATPазната пумпа или нарушување на клеточните мембрани и предизвикувајќи брз прилив на Na+, Ca2+ и вода50,51,52. Интрацитоплазматските вакуоли се јавуваат во животинските клетки како резултат на акумулација на течност во цитоплазмата поради приливот на Ca2+ и вода53. Интересно е што овој механизам на оштетување на клетките е реверзибилен ако оштетувањето е привремено и клетките почнуваат да произведуваат ATP за одреден временски период, но ако оштетувањето продолжи или се влоши, клетките умираат.54 Нашите набљудувања покажуваат дека нематодите третирани со 5-јодоиндол не се во можност да ја обноват нормалната биосинтеза по изложување на стресни услови.
Фенотипот на метилација индуциран од 5-јодоиндол кај B. xylophilus може да се должи на присуството на јод и неговата молекуларна дистрибуција, бидејќи 7-јодоиндолот имал помал инхибиторен ефект врз B. xylophilus отколку 5-јодоиндолот (Табела 1 и Дополнителна слика S6). Овие резултати се делумно во согласност со студиите на Maltese et al. (2014), кои објавија дека транслокацијата на пиридилниот азотен дел во индолот од пара- во мета-позиција ја елиминира вакуолизацијата, инхибицијата на растот и цитотоксичноста кај U251 клетките, што сугерира дека интеракцијата на молекулата со специфично активно место во протеинот е критична27,44,45. Интеракциите помеѓу индолот или халогенираните индоли и GluCL рецепторите забележани во оваа студија исто така ја поддржуваат оваа идеја, бидејќи беше откриено дека 5- и 2-јодоиндолот се врзуваат за GluCL рецепторите посилно од другите испитувани индоли (Слика 6 и Дополнителна слика S8). Јодот на втората или петтата позиција на индолот се врзува за леуцин 218 од GluCL рецепторот преку водородни врски на 'рбетот, додека другите халогенирани индоли и самиот индол формираат слаби водородни врски на страничниот ланец со серин 260 (Слика 6). Затоа шпекулираме дека локализацијата на халогенот игра важна улога во индукцијата на вакуоларна дегенерација, додека цврстото врзување на 5-јодоиндолот го одржува јонскиот канал отворен, со што се овозможува брз прилив на течности и руптура на вакуолите. Сепак, деталниот механизам на дејство на 5-јодоиндолот останува да се утврди.
Пред практичната примена на 5-јодоиндолот, треба да се анализира неговиот токсичен ефект врз растенијата. Нашите експерименти со 'ртење на семе покажаа дека 5-јодоиндолот нема негативен ефект врз 'ртењето на семето или последователните процеси на развој при проучуваните концентрации (Слика 7). Така, оваа студија дава основа за употреба на 5-јодоиндол во еколошката средина за контрола на штетноста на боровите нематоди за боровите дрвја.
Претходните извештаи покажаа дека терапијата базирана на индол претставува потенцијален пристап за решавање на проблемот со отпорност на антибиотици и прогресија на ракот55. Покрај тоа, индолите поседуваат антибактериски, антиканцерогени, антиоксидантни, антиинфламаторни, антидијабетични, антивирусни, антипролиферативни и антитуберкулозни активности и можат да послужат како ветувачка основа за развој на лекови56,57. Оваа студија за прв пат сугерира потенцијална употреба на јод како антипаразитски и антихелминтски агенс.
Авермектинот е откриен пред три децении и ја освои Нобеловата награда во 2015 година, а неговата употреба како антихелминтик сè уште е активна. Сепак, поради брзиот развој на отпорност на авермектини кај нематоди и инсекти штетници, потребна е алтернативна, ефтина и еколошка стратегија за контрола на инфекцијата со PWN кај боровите дрвја. Оваа студија, исто така, го објавува механизмот со кој 5-јодоиндолот ги убива боровите нематоди и дека 5-јодоиндолот има ниска токсичност за растителните клетки, што отвора добри перспективи за негова идна комерцијална примена.
Сите експерименти беа одобрени од Етичкиот комитет на Универзитетот Јунгнам, Гјеонгсан, Кореја, а методите беа извршени во согласност со упатствата на Етичкиот комитет на Универзитетот Јунгнам.
Експериментите со инкубација на јајца беа извршени со користење на утврдени процедури43. За да се проценат стапките на испилување (HR), возрасни нематоди стари 1 ден (приближно 100 женки и 100 мажјаци) беа префрлени во Петриеви садови што ја содржеа габата и им беше дозволено да растат 24 часа. Потоа јајцата беа изолирани и третирани со 5-јодоиндол (0,05 mM и 0,1 mM) или авермектин (10 μg/ml) како суспензија во стерилна дестилирана вода. Овие суспензии (500 μl; приближно 100 јајца) беа префрлени во бунарите на плоча за култура на ткиво со 24 бунари и инкубирани на 22 °C. Броењето на L2 беше направено по 24 часа инкубација, но се сметаше за мртво ако клетките не се поместија кога се стимулираа со фина платинска жица. Овој експеримент беше спроведен во две фази, секоја со шест повторувања. Податоците од двата експерименти беа комбинирани и презентирани. Процентот на HR се пресметува на следниов начин:
Смртноста на ларвите беше проценета со користење на претходно развиени процедури. Јајцата на нематодите беа собрани, а ембрионите беа синхронизирани со изведување во стерилна дестилирана вода за да се генерираат ларви во фаза L2. Синхронизираните ларви (приближно 500 нематоди) беа третирани со 5-јодоиндол (0,05 mM и 0,1 mM) или авермектин (10 μg/ml) и одгледани на B. cinerea Petri плочи. По 48 часа инкубација на 22 °C, нематодите беа собрани во стерилна дестилирана вода и испитани за присуство на фазите L2, L3 и L4. Присуството на фазите L3 и L4 укажуваше на ларвална трансформација, додека присуството на фазата L2 укажуваше на отсуство на трансформација. Сликите беа добиени со користење на iRiS™ Digital Cell Imaging System. Овој експеримент беше спроведен во две фази, секоја со шест повторувања. Податоците од двата експерименти беа комбинирани и презентирани.
Токсичноста на 5-јодоиндолот и авермектинот за семето беше оценета со помош на тестови за 'ртење на плочи со агар од Мурашиге и Скоог.62 Семето од B. oleracea и R. raphanistrum прво беше натопено во стерилна дестилирана вода еден ден, измиено со 1 ml 100% етанол, стерилизирано со 1 ml 50% комерцијално белило (3% натриум хипохлорит) 15 минути и измиено пет пати со 1 ml стерилна вода. Стерилизираните семиња потоа беа притиснати на плочи со агар од 'ртење што содржат 0,86 g/l (0,2X) медиум од Мурашиге и Скоог и 0,7% бактериолошки агар со или без 5-јодоиндол или авермектин. Плочите потоа беа инкубирани на 22 °C, а сликите беа направени по 3 дена инкубација. Овој експеримент беше спроведен во две фази, од кои секоја имаше шест повторувања.


Време на објавување: 26 февруари 2025 година