Боровиот нематод е карантински миграциски ендопаразит за кој е познато дека предизвикува сериозни економски загуби во екосистемите на боровите шуми. Оваа студија ја разгледува нематицидната активност на халогенираните индоли против нематоди од бор и нивниот механизам на дејство. Нематицидните активности на 5-јодоиндол и авермектин (позитивна контрола) против нематоди од бор беа слични и високи при ниски концентрации (10 μg/mL). 5-јодоиндол ја намалува плодноста, репродуктивната активност, смртноста на ембрионот и ларвите и локомоторното однесување. Молекуларните интеракции на лигандите со рецепторите на хлоридни канали специфични за безрбетниците ја поддржуваат идејата дека 5-јодоиндол, како авермектин, цврсто се врзува за активното место на рецепторот. 5-јодоиндол, исто така, предизвика различни фенотипски деформации кај нематодите, вклучувајќи абнормален колапс/смалување на органите и зголемена вакуолизација. Овие резултати сугерираат дека вакуолите може да играат улога во смртта посредувана од метилација на нематоди. Поважно е тоа што 5-јодоиндолот беше нетоксичен за двата растителни видови (зелка и ротквица). Така, оваа студија покажува дека примената на јодоиндол под услови на животната средина може да ја контролира повредата на венеењето на борот.
Нематодите од борово дрво (Bursaphelenchus xylophilus) припаѓаат на нематодите од борово дрво (PWN), миграциски ендопаразитски нематоди за кои е познато дека предизвикуваат сериозни еколошки оштетувања на екосистемите на борова шума1. Болеста на венеењето на боровите (PWD) предизвикана од нематодата од борово дрво станува сериозен проблем на неколку континенти, вклучително и Азија и Европа, а во Северна Америка, нематодата ги уништува воведените видови борови1,2. Падот на боровите дрвја е голем економски проблем, а изгледите за негово глобално ширење се загрижувачки3. Следниве видови борови најчесто се напаѓани од нематодите: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii и Pinus radiata4. Боровата нематода е сериозна болест која може да ги убие боровите во рок од неколку недели или месеци по инфекцијата. Дополнително, појавата на борови нематоди се вообичаени во различни екосистеми, па затоа се воспоставени постојани синџири на инфекции1.
Bursaphelenchus xylophilus е карантински растително-паразитски нематод кој припаѓа на суперфамилијата Aphelenchoidea и клада 102.5. Нематодата се храни со габи и се размножува во дрвените ткива на боровите дрвја, развивајќи се во четири различни ларви фази: L1, L2, L3, L4 и возрасен поединец1,6. Во услови на недостиг на храна, нематодата на борот преминува во специјализирана ларвистичка фаза - дауер, која го паразитира својот вектор - боровата кора буба (Monochamus alternatus) и се пренесува на здрави борови дрвја. Кај здравите домаќини, нематодите брзо мигрираат низ растителните ткива и се хранат со паренхиматозни клетки, што доведува до голем број на реакции на преосетливост, венење на борот и смрт во рок од една година по инфекцијата1,7,8.
Биолошката контрола на нематодите од бор долго време е предизвик, со карантински мерки кои датираат од 20 век. Тековните стратегии за контрола на нематодите на борот првенствено вклучуваат хемиски третмани, вклучувајќи дезинсекција на дрво и имплантација на нематициди во стеблата на дрвјата. Најчесто користени нематициди се авермектин и авермектин бензоат, кои припаѓаат на семејството авермектини. Овие скапи хемикалии се многу ефикасни против многу видови нематоди и се сметаат за еколошки безбедни9. Сепак, повторената употреба на овие нематициди се очекува да создаде притисок на селекција што речиси сигурно ќе доведе до појава на отпорни борови нематоди, како што е докажано за неколку штетници од инсекти, како што се Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella и нематодите Trichostrongylus colubriformis и Ostercumictagia постепено развиваат отпорност на, авермектини 10,11,12. Затоа, шемите на отпор треба редовно да се проучуваат и нематицидите постојано да се проверуваат за да се најдат алтернативни, исплатливи и еколошки мерки за контрола на PVD. Во последните децении, голем број автори предложија употреба на растителни екстракти, есенцијални масла и испарливи материи како агенси за контрола на нематоди13,14,15,16.
Неодамна ја демонстриравме нематицидната активност на индолот, меѓуклеточна и меѓуклеточна сигнална молекула, во Caenorhabditis elegans 17 . Индолот е широко распространет интрацелуларен сигнал во микробната екологија, контролирајќи бројни функции кои влијаат на микробната физиологија, формирањето на спори, стабилноста на плазмидите, отпорноста на лековите, формирањето на биофилм и вирулентноста 18, 19 . Активноста на индолот и неговите деривати против други патогени нематоди не е проучена. Во оваа студија, ја испитавме нематицидната активност на 34 индоли против нематоди од бор и го разјаснивме механизмот на дејство на најмоќниот 5-јодоиндол со помош на микроскопија, фотографирање со време-лапс и експерименти со молекуларно приклучување и ги проценивме неговите токсични ефекти врз растенијата користејќи анализа на ртење на семето.
Претходно беше пријавено дека високите концентрации (>1,0 mM) на индол имаат нематицидно дејство врз нематодите17. По третманот на B. xylophilus (мешани животни фази) со индол или 33 различни деривати на индол на 1 mM, смртноста на B. xylophilus беше измерена со броење живи и мртви нематоди во контролната и третираната група. Пет индоли покажаа значителна нематицидна активност; преживувањето на нетретираната контролна група беше 95 ± 7% по 24 часа. Од 34 тестирани индоли, 5-јодоиндол и 4-флуороиндол на 1 mM предизвикаа 100% смртност, додека 5,6-дифлуороиндиго, метилиндол-7-карбоксилат и 7-јодоиндол предизвикаа приближно 50% смртност (Табела 1).
Ефект на 5-јодоиндол врз формирањето на вакуоли и метаболизмот на нематодата од борово дрво. (А) Ефектот на авермектин и 5-јодоиндол на возрасни машки нематоди, (Б) јајца од нематоди од L1 фаза и (C) метаболизам на B. xylophilus, (i) вакуоли не беа забележани на 0 часа, третманот резултираше со (ii) вакуоли, (iii) акумулација, бунар на вакуоли (ив) фузија на вакуоли и (vi) формирање на џиновски вакуоли. Црвените стрелки укажуваат на отекување на вакуоли, сините стрелки укажуваат на спојување на вакуоли, а црните стрелки покажуваат џиновски вакуоли. Лента за скала = 50 μm.
Дополнително, оваа студија го опиша и секвенцијалниот процес на смрт предизвикана од метан кај боровите нематоди (Слика 4C). Метаногената смрт е неапоптозен тип на клеточна смрт поврзана со акумулација на истакнати цитоплазматски вакуоли27. Морфолошките дефекти забележани кај нематодите од бор се чини дека се тесно поврзани со механизмот на смрт предизвикана од метан. Микроскопското испитување во различни периоди покажало дека џиновските вакуоли биле формирани по 20 часа изложеност на 5-јодоиндол (0,1 mM). Микроскопските вакуоли беа забележани по 8 часа од третманот, а нивниот број се зголеми по 12 часа. Неколку големи вакуоли беа забележани по 14 часа. Неколку споени вакуоли беа јасно видливи по 12-16 часа од третманот, што покажува дека фузијата на вакуоли е основата на механизмот на метаногена смрт. По 20 часа, низ целиот црв беа пронајдени неколку џиновски вакуоли. Овие набљудувања го претставуваат првиот извештај за метуоза кај C. elegans.
Кај црвите третирани со 5-јодоиндол, исто така беше забележана агрегација и руптура на вакуолата (сл. 5), како што беше потврдено со свиткување на црви и ослободување на вакуоли во околината. Нарушување на вакуолите беше забележано и во мембраната на лушпата од јајцето, која вообичаено е зачувана недопрена од L2 за време на шрафирањето (Дополнителна слика S2). Овие набљудувања го поддржуваат вклучувањето на акумулација на течност и осморегулаторна инсуфициенција, како и реверзибилна клеточна повреда (RCI), во процесот на формирање и супурација на вакуоли (сл. 5).
Претпоставувајќи ја улогата на јодот во набљудуваното формирање на вакуоли, ја истражувавме нематицидната активност на натриум јодид (NaI) и калиум јодид (КИ). Меѓутоа, во концентрации (0,1, 0,5 или 1 mM), тие не влијаеле ниту на преживувањето на нематодите ниту на формирањето на вакуоли (Дополнителна слика S5), иако 1 mM KI имал мал нематициден ефект. Од друга страна, 7-јодоиндол (1 или 2 mM), како 5-јодоиндол, предизвика повеќе вакуоли и структурни деформации (Дополнителна слика S6). Двата јодоиндола покажаа слични фенотипски карактеристики кај нематодите од бор, додека NaI и KI не. Интересно, индолот не предизвикал формирање на вакуоли во B. xylophilus во концентрациите што биле тестирани (податоците не се прикажани). Така, резултатите потврдија дека комплексот индол-јод е одговорен за вакуолизацијата и метаболизмот на B. xylophilus.
Меѓу индолите тестирани за нематицидна активност, 5-јодоиндол имаше највисок индекс на лизгање од -5,89 kcal/mol, проследено со 7-јодоиндол (-4,48 kcal/mol), 4-флуороиндол (-4,33) и индол (-4,03) (Слика 6). Силната рбетна водородна врска на 5-јодоиндол со леуцин 218 го стабилизира неговото врзување, додека сите други деривати на индол се врзуваат за серин 260 преку странични водородни врски. Помеѓу другите моделирани јодоиндол, 2-јодоиндол има врзувачка вредност од -5,248 kcal/mol, што се должи на неговата главна водородна врска со леуцин 218. Други познати сврзувања вклучуваат 3-јодоиндол (-4,3 kcal/mol), 4-јодоиндол (-4,0 kcal/mol), и 6.0 kcal/mol/6. kcal/mol) (Дополнителна слика S8). Повеќето халогени индоли и самиот индол, со исклучок на 5-јодоиндол и 2-јодоиндол, формираат врска со серин 260. Фактот дека водородното поврзување со леуцин 218 е показател за ефикасно врзување на рецептор-лиганд, како што е забележано за ивермектин (Дополнително-iodoindole5 Сл. 2-јодоиндол, како ивермектин, цврсто се врзува за активното место на рецепторот GluCL преку леуцин 218 (сл. 6 и дополнителна слика S8). Предлагаме дека ова врзување е потребно за да се одржи структурата на отворените пори на комплексот GluCL и дека со цврсто врзување за активното место на рецепторот GluCL, 5-јодоиндол, 2-јодоиндол, авермектин и ивермектин со што се одржува отворен јонскиот канал и се овозможува навлегување течности.
Молекуларно спојување на индол и халогениран индол во GluCL. Ориентации на врзување на (A) индол, (B) 4-флуороиндол, (C) 7-јодоиндол и (D) 5-јодоиндол лиганди на активното место на GluCL. Протеинот е претставен со лента, а водородните врски на 'рбетот се прикажани како жолти точки. (A'), (B'), (C') и (D') ги прикажуваат интеракциите на соодветните лиганди со околните амино киселински остатоци, а водородните врски со страничниот ланец се означени со розови точки со стрелки.
Беа спроведени експерименти за да се оцени токсичниот ефект на 5-јодоиндол врз ртење на семето од зелка и ротквица. 5-јодоиндол (0,05 или 0,1 mM) или авермектин (10 μg/mL) имаа мал или никаков ефект врз првичното ртење и никнувањето на растенијата (Слика 7). Дополнително, не беше пронајдена значајна разлика помеѓу стапката на 'ртење на нетретираните контроли и семињата третирани со 5-јодоиндол или авермектин. Ефектот на издолжувањето на коренот и бројот на странични корени беше незначителен, иако 1 mM (10 пати повеќе од неговата активна концентрација) 5-јодоиндол малку го одложи развојот на страничните корени. Овие резултати покажуваат дека 5-јодоиндолот е нетоксичен за растителните клетки и не ги попречува процесите на развој на растенијата при проучуваните концентрации.
Ефект на 5-јодоиндол врз ртење на семето. Ртење, ртење и странично вкоренување на семињата B. oleracea и R. raphanistrum на медиум Murashige и Skoog агар со или без авермектин или 5-јодоиндол. Ртење беше забележано по 3 дена инкубација на 22°C.
Оваа студија известува за неколку случаи на убивање на нематоди со индоли. Поважно, ова е прв извештај за метилација што предизвикува јодоиндол (процес предизвикан од акумулација на мали вакуоли кои постепено се спојуваат во огромни вакуоли, што на крајот доведува до кинење на мембраната и смрт) во борови иглички, при што јодоиндол покажува значителни нематицидни својства слични на оние на комерцијалниот нематицид averm.
Претходно беше пријавено дека индолите вршат повеќекратни сигнални функции кај прокариотите и еукариотите, вклучително и инхибиција/формирање на биофилм, бактериско преживување и патогеност19,32,33,34. Неодамна, потенцијалните терапевтски ефекти на халогенирани индоли, индол алкалоиди и полусинтетички деривати на индол привлекоа голем истражувачки интерес35,36,37. На пример, покажано е дека халогенираните индоли ги убиваат упорните клетки на ешерихија коли и стафилококус ауреус37. Дополнително, од научен интерес е да се проучува ефикасноста на халогенираните индоли против други видови, родови и кралства, а оваа студија е чекор кон постигнување на оваа цел.
Овде, предлагаме механизам за смртност предизвикана од 5-јодоиндол кај C. elegans врз основа на реверзибилна клеточна повреда (RCI) и метилација (слики 4C и 5). Едематозните промени како што се подпухналост и вакуоларна дегенерација се индикатори за RCI и метилација, манифестирани како џиновски вакуоли во цитоплазмата48,49. RCI се меша во производството на енергија со намалување на производството на АТП, предизвикувајќи дефект на пумпата на АТПаза или нарушување на клеточните мембрани и предизвикувајќи брз прилив на Na+, Ca2+ и вода50,51,52. Интрацитоплазматските вакуоли се појавуваат во животинските клетки како резултат на акумулација на течност во цитоплазмата поради приливот на Ca2+ и вода53. Интересно е што овој механизам на клеточно оштетување е реверзибилен ако оштетувањето е привремено и клетките почнат да произведуваат АТП одреден временски период, но ако оштетувањето опстојува или се влоши, клетките умираат.54 Нашите набљудувања покажуваат дека нематодите третирани со 5-јодоиндол не се во можност да ја вратат нормалната биосинтеза по изложување на стресни услови.
Фенотипот на метилација индуциран од 5-јодоиндол во B. xylophilus може да се должи на присуството на јод и неговата молекуларна дистрибуција, бидејќи 7-јодоиндол имаше помал инхибиторен ефект врз B. xylophilus отколку 5-јодоиндол (Табела 1 и дополнителна слика S6). Овие резултати се делумно конзистентни со студиите на Малтезе и сор. (2014), кој објави дека транслокацијата на делот од пиридил азот во индол од пара- во мета-позиција ја укина вакуолизацијата, инхибицијата на растот и цитотоксичноста во U251 клетките, што сугерира дека интеракцијата на молекулата со специфично активно место во протеинот е критична25,44, Интеракциите помеѓу индол или халогенирани индоли и GluCL рецептори забележани во оваа студија, исто така, го поддржуваат овој поим, бидејќи беше откриено дека 5- и 2-јодоиндол се врзуваат за GluCL рецепторите посилно од другите испитани индоли (Слика 6 и дополнителна слика S8). Откриено е дека јодот на втората или петтата позиција на индолот се врзува за леуцин 218 од рецепторот GluCL преку водородни врски во 'рбетот, додека другите халогенирани индоли и самиот индол формираат слаби странични водородни врски со серин 260 (Слика 6). Затоа шпекулираме дека локализацијата на халогенот игра важна улога во индукцијата на вакуоларната дегенерација, додека цврстото врзување на 5-јодоиндол го одржува јонскиот канал отворен, а со тоа овозможува брз прилив на течност и руптура на вакуолата. Сепак, деталниот механизам на дејство на 5-јодоиндол останува да се утврди.
Пред практична примена на 5-јодоиндол, треба да се анализира неговиот токсичен ефект врз растенијата. Нашите експерименти со ртење на семето покажаа дека 5-јодоиндол нема негативен ефект врз ртење на семето или последователните развојни процеси во проучуваните концентрации (Слика 7). Така, оваа студија дава основа за употреба на 5-јодоиндол во еколошката средина за контрола на штетноста на боровите нематоди за боровите дрвја.
Претходните извештаи покажаа дека терапијата базирана на индол претставува потенцијален пристап за решавање на проблемот со отпорноста на антибиотици и прогресијата на ракот55. Покрај тоа, индолите поседуваат антибактериски, антиканцерогени, антиоксидантни, антиинфламаторни, антидијабетични, антивирусни, антипролиферативни и антитуберкулозни активности и може да послужат како ветувачка основа за развој на лекови56,57. Оваа студија за прв пат сугерира потенцијална употреба на јод како антипаразитски и антихелминтски агенс.
Авермектинот е откриен пред три децении и ја доби Нобеловата награда во 2015 година, а неговата употреба како антихелминтик сè уште е активно во тек. Сепак, поради брзиот развој на отпорност на авермектини кај нематодите и штетниците од инсекти, потребна е алтернативна, евтина и еколошка стратегија за контрола на инфекцијата со PWN кај боровите дрвја. Оваа студија исто така го известува механизмот со кој 5-јодоиндол ги убива боровите нематоди и дека 5-јодоиндолот има ниска токсичност за растителните клетки, што отвора добри изгледи за неговата идна комерцијална примена.
Сите експерименти беа одобрени од Етичкиот комитет на Универзитетот Јеунгнам, Гјеонгсан, Кореја, а методите беа изведени во согласност со упатствата на Етичкиот комитет на Универзитетот Јеунгнам.
Експериментите за инкубација на јајца беа изведени со употреба на воспоставени процедури43. За да се процени стапката на шрафирање (HR), возрасни нематоди стари 1 ден (приближно 100 женки и 100 мажјаци) беа префрлени во садовите Петри кои ја содржат габата и им беше дозволено да растат 24 часа. Јајцата потоа беа изолирани и третирани со 5-јодоиндол (0,05 mM и 0,1 mM) или авермектин (10 μg/ml) како суспензија во стерилна дестилирана вода. Овие суспензии (500 μl; приближно 100 јајца) беа префрлени во бунарите на плочата за култура на ткиво со 24 бунари и инкубирани на 22 °C. Броевите на L2 беа направени по 24 часа од инкубацијата, но се сметаа за мртви ако клетките не се поместуваат кога се стимулираат со фина платина жица. Овој експеримент беше спроведен во две фази, секоја со шест повторувања. Податоците од двата експерименти беа комбинирани и презентирани. Процентот на човечки ресурси се пресметува на следниов начин:
Смртноста на ларвите беше проценета со користење на претходно развиени процедури. Јајцата од нематоди беа собрани и ембрионите беа синхронизирани со шрафирање во стерилна дестилирана вода за да се генерираат ларви од фазата L2. Синхронизираните ларви (приближно 500 нематоди) беа третирани со 5-јодоиндол (0,05 mM и 0,1 mM) или авермектин (10 μg/ml) и се одгледуваа на B. cinerea Петри плочи. По 48 часа инкубација на 22 °C, нематодите беа собрани во стерилна дестилирана вода и испитувани за присуство на стадиуми L2, L3 и L4. Присуството на стадиумите L3 и L4 укажува на трансформација на ларви, додека присуството на фазата L2 не покажува трансформација. Сликите беа добиени со помош на системот за дигитална клеточна слика iRiS™. Овој експеримент беше спроведен во две фази, секоја со шест повторувања. Податоците од двата експерименти беа комбинирани и презентирани.
Токсичноста на 5-јодоиндол и авермектин за семињата беше проценета со помош на тестови за 'ртење на плочите со Murashige и Skoog агар.62 Семињата B. oleracea и R. raphanistrum најпрво беа натопени во стерилна дестилирана вода еден ден, измиени со 1 ml 100% 100% стерилизиран со етанол. натриум хипохлорит) 15 мин. и се мие пет пати со 1 ml стерилна вода. Стерилизираните семиња потоа беа притиснати на плочи со агар за 'ртење кои содржат 0,86 g/l (0,2X) медиум Murashige и Skoog и 0,7% бактериолошки агар со или без 5-јодоиндол или авермектин. Плочите потоа беа инкубирани на 22 °C, а сликите беа направени по 3 дена инкубација. Овој експеримент беше спроведен во две фази, од кои секоја имаше шест повторувања.
Време на објавување: 26 февруари 2025 година