Фосфорилацијата го активира главниот регулатор за раст DELLA, промовирајќи врзување на хистон H2A за хроматин во Arabidopsis.

Протеините DELLA се зачуванирегулатори на расткои играат централна улога во развојот на растенијата како одговор на внатрешните и надворешните сигнали. Како регулатори на транскрипција, DELLA се врзуваат за факторите на транскрипција (TFs) и хистонот H2A преку нивните GRAS домени и се регрутираат да дејствуваат на промоторите. Неодамнешните студии покажаа дека стабилноста на DELLA се регулира пост-транслационално со два механизми: полиубиквитинација индуцирана од растителниот хормонгиберелини, што доведува до нивна брза деградација и конјугација со мал модификатор сличен на убиквитин (SUMO), што ја зголемува нивната акумулација. Покрај тоа, активноста на DELLA е динамично регулирана со два различни механизми за гликозилација: О-фукозилацијата ја подобрува интеракцијата DELLA-TF, додека модификацијата на O-поврзаниот N-ацетилглукозамин (O-GlcNAc) ја инхибира DELLA-TF интеракцијата. Сепак, улогата на фосфорилацијата на DELLA е нејасна бидејќи претходните студии покажаа спротивставени резултати, при што некои сугерираат дека фосфорилацијата ја промовира или потиснува деградацијата на DELLA, а други сугерираат дека фосфорилацијата не влијае на нивната стабилност. Овде, ги идентификуваме местата на фосфорилација во репресорот GA1-3 (RGA), AtDELLA, прочистен од Arabidopsis thaliana со масена спектрометрија и покажуваме дека фосфорилацијата на два RGA пептиди во PolyS и PolyS/T регионите ја подобрува активноста на RGA преку промовирање на врзувањето на H2A и RGA асоцијација со таргети. Имено, фосфорилацијата не влијаеше на интеракциите на RGA-TF или на RGA стабилноста. Нашата студија открива молекуларен механизам со кој фосфорилацијата индуцира активност на DELLA.
Нашата масовна спектрометриска анализа откри дека и Pep1 и Pep2 беа високо фосфорилирани во RGA во позадината со GA-дефицит на Ga1. Покрај оваа студија, фосфопротеомските студии исто така открија фосфорилација на Pep1 во RGA, иако нејзината улога сè уште не е проучена53,54,55. Спротивно на тоа, фосфорилацијата Pep2 не е претходно опишана бидејќи овој пептид може да се открие само со помош на трансгенот RGAGKG. Иако мутацијата m1A, која ја укина фосфорилацијата на Pep1, само малку ја намали RGA активноста во планта, таа имаше адитивен ефект кога се комбинира со m2A во намалувањето на RGA активноста (Дополнителна слика 6). Поважно, Pep1 фосфорилацијата беше значително намалена во GA-подобрениот sly1 мутант во споредба со ga1, што сугерира дека GA промовира RGA дефосфорилација, намалувајќи ја неговата активност. Механизмот со кој GA ја потиснува RGA фосфорилацијата бара дополнително истражување. Една можност е тоа да се постигне преку регулација на неидентификувана протеинска киназа. Иако студиите покажаа дека изразувањето на CK1 протеинот киназа EL1 е намалено регулирано со GA во оризот41, нашите резултати покажуваат дека мутациите од повисок ред на Arabidopsis EL1 хомологот (AEL1-4) не ја намалуваат RGA фосфорилацијата. Во согласност со нашите резултати, една неодамнешна фосфопротеомска студија користејќи линии за прекумерно изразување на Arabidopsis AEL и троен мутант на ael не идентификуваше ниту еден DELLA протеин како супстрат на овие кинази56. Кога го подготвивме ракописот, беше објавено дека GSK3, генот што кодира киназа слична на GSK3/SHAGGY во пченицата (Triticum aestivum), може да ја фосфорилира DELLA (Rht-B1b)57, иако фосфорилацијата на Rht-B1b од GSK3 не е потврдена во растението. Ин витро ензимските реакции во присуство на GSK3 проследени со анализа на масена спектрометрија открија три места на фосфорилација лоцирани помеѓу домените DELLA и GRAS на Rht-B1b (Дополнителна слика 3). Замените на серин со аланин на сите три места на фосфорилација резултираа со намалена активност на Rht-B1b во трансгенската пченица, во согласност со нашите наоди дека замените на аланин во Pep2 RGA ја намалија активноста на RGA. Сепак, ин витро анализите за деградација на протеини дополнително покажаа дека фосфорилацијата може да го стабилизира и Rht-B1b57. Ова е спротивно на нашите резултати кои покажуваат дека супституциите на аланин во Pep2 RGA не ја менуваат неговата стабилност во планта. GSK3 во пченицата е ортолог на брасиностероид нечувствителен протеин 2 (BIN2) во Arabidopsis 57. BIN2 е негативен регулатор на BR сигнализацијата, а BR го активира својот сигнален пат предизвикувајќи деградација на BIN2. (Дополнителна слика 2), што сугерира дека RGA веројатно нема да биде фосфорилирана од BIN2.
Сите квантитативни податоци беа статистички анализирани со помош на Excel, а значајните разлики беа утврдени со помош на Студентскиот t-тест. Не беа користени статистички методи за однапред да се одреди големината на примерокот. Ниту еден податок не беше исклучен од анализата; експериментот не беше рандомизиран; а истражувачите биле свесни за распределбата за време на експериментот и проценката на исходот. Големините на примероците се дадени во легендите на сликите и во датотеките со необработени податоци.