Протеините DELLA се конзервиранирегулатори на расткои играат централна улога во развојот на растенијата како одговор на внатрешни и надворешни сигнали. Како транскрипциски регулатори, DELLA се врзуваат за транскрипциски фактори (TF) и хистон H2A преку нивните GRAS домени и се регрутираат за да дејствуваат на промоторите. Неодамнешните студии покажаа дека стабилноста на DELLA е регулирана пост-транслационо преку два механизма: полиубиквитинација предизвикана од растителниот хормонгиберелин, што доведува до нивна брза деградација и конјугација со мал модификатор сличен на убиквитин (SUMO), што ја зголемува нивната акумулација. Покрај тоа, активноста на DELLA е динамички регулирана од два различни механизми на гликозилација: О-фукозилацијата ја подобрува интеракцијата DELLA-TF, додека модификацијата на О-поврзаниот N-ацетилглукозамин (O-GlcNAc) ја инхибира интеракцијата DELLA-TF. Сепак, улогата на фосфорилацијата на DELLA е нејасна бидејќи претходните студии покажаа спротивставени резултати, при што некои сугерираат дека фосфорилацијата ја промовира или потиснува деградацијата на DELLA, а други сугерираат дека фосфорилацијата не влијае на нивната стабилност. Овде, ги идентификуваме местата на фосфорилација во GA1-3 репресорот (RGA), AtDELLA, прочистен од Arabidopsis thaliana со масена спектрометрија и покажуваме дека фосфорилацијата на два RGA пептиди во регионите PolyS и PolyS/T ја подобрува активноста на RGA со промовирање на врзувањето на H2A и поврзувањето на RGA со целните промотори. Имено, фосфорилацијата не влијаеше на интеракциите RGA-TF или на стабилноста на RGA. Нашето истражување открива молекуларен механизам преку кој фосфорилацијата индуцира DELLA активност.
Нашата масена спектрометриска анализа покажа дека и Pep1 и Pep2 беа високо фосфорилирани во RGA во Ga1 позадината со недостаток на GA. Покрај оваа студија, фосфопротеомските студии, исто така, открија фосфорилација на Pep1 во RGA, иако нејзината улога сè уште не е проучена53,54,55. Спротивно на тоа, фосфорилацијата на Pep2 не е опишана претходно бидејќи овој пептид можеше да се открие само со помош на трансгенот RGAGKG. Иако мутацијата m1A, која ја укина фосфорилацијата на Pep1, само малку ја намали активноста на RGA кај растенијата, таа имаше адитивен ефект кога се комбинираше со m2A во намалувањето на активноста на RGA (Дополнителна слика 6). Важно е да се напомене дека фосфорилацијата на Pep1 беше значително намалена кај мутантот sly1 засилен со GA во споредба со ga1, што сугерира дека GA ја промовира дефосфорилацијата на RGA, намалувајќи ја неговата активност. Механизмот со кој GA ја потиснува фосфорилацијата на RGA бара понатамошно истражување. Една можност е дека ова се постигнува преку регулација на неидентификувана протеинска киназа. Иако студиите покажаа дека експресијата на CK1 протеин киназата EL1 е намалена од GA кај оризот41, нашите резултати укажуваат дека мутациите од повисок ред на хомологот на Arabidopsis EL1 (AEL1-4) не ја намалуваат фосфорилацијата на RGA. Во согласност со нашите резултати, неодамнешна фосфопротеомска студија со користење на линии што преекспресираат Arabidopsis AEL и троен мутант на ael не идентификуваше никакви DELLA протеини како супстрати на овие кинази56. Кога го подготвивме ракописот, беше објавено дека GSK3, генот што кодира GSK3/SHAGGY-слична киназа кај пченицата (Triticum aestivum), може да ја фосфорилира DELLA (Rht-B1b)57, иако фосфорилацијата на Rht-B1b од страна на GSK3 не е потврдена кај растенијата. Ин витро ензимските реакции во присуство на GSK3 проследени со анализа на масена спектрометрија открија три места на фосфорилација лоцирани помеѓу домените DELLA и GRAS на Rht-B1b (Дополнителна слика 3). Супституциите на серин во аланин на сите три места на фосфорилација резултираа со намалена активност на Rht-B1b кај трансгена пченица, што е во согласност со нашите наоди дека супституциите на аланин во Pep2 RGA ја намалија активноста на RGA. Сепак, тестовите за деградација на протеини in vitro дополнително покажаа дека фосфорилацијата може да го стабилизира и Rht-B1b57. Ова е спротивно на нашите резултати што покажуваат дека супституциите на аланин во Pep2 RGA не ја менуваат неговата стабилност во растенијата. GSK3 во пченицата е ортолог на протеинот 2 нечувствителен на брасиностероид (BIN2) во Arabidopsis 57. BIN2 е негативен регулатор на BR сигнализацијата, а BR го активира неговиот сигнален пат со предизвикување деградација на BIN2 58. Покажавме дека третманот со BR не ја намалува стабилноста на RGA 59 или нивоата на фосфорилација во Arabidopsis (Дополнителна слика 2), што сугерира дека RGA веројатно нема да биде фосфорилирана од BIN2.
Сите квантитативни податоци беа статистички анализирани со помош на Excel, а значајните разлики беа утврдени со помош на Студентовиот t-тест. Не беа користени статистички методи за претходно одредување на големината на примерокот. Од анализата не беа исклучени податоци; експериментот не беше рандомизиран; а истражувачите беа свесни за распределбата за време на експериментот и проценката на резултатите. Големините на примероците се дадени во легендите на сликите и во датотеките со сурови податоци.
Време на објавување: 15 април 2025 година