Растот на апикалниот меристем (SAM) е критичен за архитектурата на стеблото. Растителни хормонигиберелини(GA) играат клучна улога во координирањето на растот на растенијата, но нивната улога во SAM останува слабо разбрана. Овде, развивме ратиометриски биосензор за GA сигнализација со инженерство на протеинот DELLA за да ја потисне неговата суштинска регулаторна функција во транскрипцискиот одговор на GA, додека ја зачувува неговата деградација при препознавањето на GA. Докажуваме дека овој биосензор базиран на деградација прецизно ги снима промените во нивоата на ГА и клеточното сензорирање за време на развојот. Го користевме овој биосензор за да ја мапираме сигналната активност на GA во SAM. Покажуваме дека високите GA сигнали се присутни претежно во клетките лоцирани помеѓу примордијата на органите, кои се претходници на меѓунодните клетки. Користејќи ги пристапите за добивка и губење на функцијата, дополнително докажуваме дека GA ја регулира ориентацијата на рамнината на клеточната делба, воспоставувајќи ја канонската клеточна организација на меѓујазлите, а со тоа промовирајќи ја спецификацијата на интерноди во SAM.
Апикалниот меристем (SAM), кој се наоѓа на врвот на пукањето, содржи ниша од матични клетки чија активност генерира странични органи и матични јазли на модуларен и итеративен начин во текот на животот на растението. Секоја од овие повторливи единици, или растителни јазли, вклучува меѓујазли и странични органи на јазлите и аксиларни меристеми во пазувите на листот1. Растот и организацијата на јазлите на растенијата се менуваат во текот на развојот. Кај Arabidopsis, меѓунодалниот раст е потиснат за време на вегетативната фаза, а аксиларните меристеми остануваат неактивни во пазувите на листовите од розета. За време на транзицијата кон цветната фаза, САМ станува меристем на соцветите, генерирајќи издолжени меѓујазли и аксиларни пупки, гранки во пазувите на листовите од карфија, а подоцна и цветови без лисја2. Иако постигнавме значителен напредок во разбирањето на механизмите кои го контролираат започнувањето на лисјата, цветовите и гранките, релативно малку се знае за тоа како се појавуваат меѓујазли.
Разбирањето на просторнотемпоралната дистрибуција на ГА ќе помогне подобро да се разберат функциите на овие хормони во различни ткива и во различни развојни фази. Визуелизацијата на деградацијата на RGA-GFP фузијата изразена под дејство на сопствениот промотор дава важни информации за регулирањето на вкупните нивоа на GA во корените15,16. Сепак, изразувањето на RGA варира низ ткивата17 и е регулирано со GA18. Така, диференцијалното изразување на RGA промоторот може да резултира со флуоресцентен модел забележан со RGA-GFP и затоа овој метод не е квантитативен. Во поново време, биоактивен флуоресцеин (Fl)-означен GA19,20 откри акумулација на ГА во коренскиот ендокортекс и регулирање на неговите клеточни нивоа со транспорт на ГА. Неодамна, сензорот GA FRET nlsGPS1 покажа дека нивоата на GA се во корелација со издолжувањето на клетките во корените, филаментите и хипокотилите21. Сепак, како што видовме, концентрацијата на GA не е единствениот параметар што ја контролира сигналната активност на GA, бидејќи зависи од сложените процеси на сензори. Овде, надоврзувајќи се на нашето разбирање за DELLA и GA сигналните патишта, го известуваме развојот и карактеризацијата на ратиометриски биосензор заснован на деградација за GA сигнализација. За да го развиеме овој квантитативен биосензор, користевме мутант GA-чувствителен RGA кој беше споен со флуоресцентен протеин и сеприсутно изразен во ткивата, како и флуоресцентен протеин осетлив на ГА. Покажуваме дека фузијата на мутантниот RGA протеин не се меша со ендогеното GA сигнализирање кога е сеприсутно изразено, и дека овој биосензор може да ја квантифицира сигналната активност што е резултат и од влезот на GA и од обработката на сигналот GA од сензорскиот апарат со висока просторнотемпорална резолуција. Го користевме овој биосензор за да ја мапираме просторновременската дистрибуција на сигналната активност на ГА и да измериме како GA го регулира клеточното однесување во епидермисот SAM. Докажуваме дека GA ја регулира ориентацијата на рамнината на поделба на SAM-клетките лоцирани помеѓу органите примордија, со што се дефинира канонската клеточна организација на интернодата.
Конечно, прашавме дали qmRGA може да пријави промени во нивоата на ендогени ГА користејќи растечки хипокотили. Претходно покажавме дека нитратот го стимулира растот со зголемување на синтезата на GA и, пак, деградацијата на DELLA34. Соодветно на тоа, забележавме дека должината на хипокотилот кај садници pUBQ10:: qmRGA одгледувани под обилно снабдување со нитрати (10 mM NO3-) беше значително подолга од онаа кај садници одгледувани во услови со недостаток на нитрати (Дополнителна слика 6а). Во согласност со одговорот на растот, GA сигналите беа повисоки кај хипокотилите на садници одгледувани во услови на 10 mM NO3- отколку кај садници одгледувани во отсуство на нитрат (Дополнителна слика 6б, в). Така, qmRGA исто така овозможува следење на промените во GA сигнализацијата предизвикани од ендогени промени во концентрацијата на GA.
За да разбереме дали активноста на сигнализација GA откриена од qmRGA зависи од концентрацијата на GA и перцепцијата на GA, како што се очекуваше врз основа на дизајнот на сензорот, го анализиравме изразот на трите GID1 рецептори во вегетативните и репродуктивните ткива. Кај садници, линијата известувач GID1-GUS покажа дека GID1a и c беа високо изразени во котиледоните (сл. 3а-в). Дополнително, сите три рецептори беа изразени во лисјата, страничните коренски примордија, врвовите на коренот (освен коренот на GID1b) и васкуларниот систем (сл. 3а-в). Во SAM соцветите, откривме GUS сигнали само за GID1b и 1c (Дополнителна слика 7a-c). In situ хибридизацијата ги потврди овие шеми на изразување и дополнително покажа дека GID1c беше рамномерно изразен на ниски нивоа во SAM, додека GID1b покажа поголем израз на периферијата на SAM (Дополнителна слика 7d-l). Преведувачката фузија pGID1b::2xmTQ2-GID1b, исто така, откри степенуван опсег на изразување на GID1b, од низок или без израз во центарот на SAM до висока експресија на границите на органите (Дополнителна слика 7m). Така, GID1 рецепторите не се рамномерно распоредени низ и во ткивата. Во последователните експерименти, исто така, забележавме дека прекумерната експресија на GID1 (pUBQ10:: GID1a-mCherry) ја зголеми чувствителноста на qmRGA кај хипокотилите на надворешна апликација GA (сл. 3d, e). Спротивно на тоа, флуоресценцијата измерена со qd17mRGA во хипокотилот беше нечувствителна на третман со GA3 (сл. 3f, g). За двете анализи, садниците беа третирани со високи концентрации на GA (100 μM GA3) за да се процени брзото однесување на сензорот, каде што способноста да се врзат за рецепторот GID1 беше подобрена или изгубена. Заедно, овие резултати потврдуваат дека биосензорот qmRGA служи комбинирана функција како GA и GA сензор и сугерираат дека диференцијалното изразување на рецепторот GID1 може значително да ја модулира емисивноста на сензорот.
До денес, дистрибуцијата на GA сигналите во SAM останува нејасна. Затоа, користевме растенија што изразуваат qmRGA и известувачот за матични клетки pCLV3::mCherry-NLS35 за да пресметаме квантитативни мапи со висока резолуција на сигналната активност на GA, фокусирајќи се на слојот L1 (епидермисот; Сл. 4а, б, видете Методи и дополнителни методи на SAM игра клучна улога во 31 АМ). Овде, изразот pCLV3::mCherry-NLS обезбеди фиксна геометриска референтна точка за анализа на просторновременската дистрибуција на GA сигналната активност37. Иако GA се смета за суштински за развој на страничните органи4, забележавме дека GA сигналите беа ниски во цветниот примордиум (P) почнувајќи од фазата P3 (сл. 4а, б), додека младите P1 и P2 примордиуми имаа умерена активност слична на онаа во централниот регион (сл. 4а, б). Повисока сигнална активност на GA беше откриена на границите на примордиумот на органот, почнувајќи од P1/P2 (на страните на границата) и достигнувајќи врв на P4, како и во сите клетки од периферниот регион лоциран помеѓу примордијата (сл. 4а, б и дополнителна слика 8а, б). Оваа повисока GA сигнална активност беше забележана не само во епидермисот, туку и во L2 и горните L3 слоеви (Дополнителна слика 8б). Моделот на GA сигнали откриени во SAM користејќи qmRGA, исто така, остана непроменет со текот на времето (Дополнителна слика 8c-f, k). Иако конструкцијата qd17mRGA беше систематски намалена во SAM на растенијата T3 од пет независни линии што ги карактеризиравме детално, можевме да ги анализираме флуоресцентните модели добиени со конструкцијата pRPS5a:: VENUS-2A-TagBFP (Дополнителна слика 8g-j, l). Во оваа контролна линија, само мали промени во односот на флуоресценција беа откриени во SAM, но во SAM центарот забележавме јасно и неочекувано намалување на VENUS поврзано со TagBFP. Ова потврдува дека моделот на сигнализација забележан од qmRGA ја рефлектира GA-зависната деградација на mRGA-VENUS, но исто така покажува дека qmRGA може да ја прецени сигналната активност на GA во центарот на меристемот. Накратко, нашите резултати откриваат шема на сигнализација GA која првенствено ја одразува дистрибуцијата на примордија. Оваа дистрибуција на интер-примордијалниот регион (IPR) се должи на постепеното воспоставување на висока GA сигнална активност помеѓу примордиумот во развој и централниот регион, додека во исто време GA сигналната активност во примордиумот се намалува (сл. 4c, d).
Дистрибуцијата на рецепторите GID1b и GID1c (види погоре) сугерира дека диференцијалното изразување на GA рецепторите помага да се обликува моделот на GA сигналната активност во SAM. Се прашувавме дали може да биде вклучена диференцијална акумулација на ГА. За да ја истражиме оваа можност, го користевме сензорот nlsGPS1 GA FRET21. Зголемена фреквенција на активирање беше откриена во SAM на nlsGPS1 третиран со 10 μM GA4+7 за 100 мин (Дополнителна слика 9a–e), што покажува дека nlsGPS1 реагира на промените во концентрацијата на GA во SAM, како што тоа го прави во корените21. Просторната дистрибуција на фреквенцијата на активирање nlsGPS1 откри релативно ниски нивоа на GA во надворешните слоеви на SAM, но покажа дека тие се покачени во центарот и на границите на SAM (сл. 4e и дополнителна слика 9а, в). Ова сугерира дека GA е исто така дистрибуиран во SAM со просторна шема споредлива со онаа откриена од qmRGA. Како комплементарен пристап, ние исто така го третиравме SAM со флуоресцентни GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) или само Fl како негативна контрола. Сигналот Fl беше дистрибуиран низ SAM, вклучувајќи го централниот регион и примордиумот, иако со помал интензитет (сл. 4j и дополнителна слика 10д). Спротивно на тоа, сите три GA-Fl се акумулирале специфично во границите на примордиумот и во различни степени во остатокот од IPR, при што GA7-Fl се акумулирал во најголемиот домен во IPR (сл. 4k и дополнителна слика 10a,b). Квантификацијата на интензитетот на флуоресценција откри дека односот на интензитетот на IPR кон не-IPR е повисок кај SAM третиран со GA-Fl во споредба со SAM третиран со Fl (сл. 4l и дополнителна слика 10в). Заедно, овие резултати сугерираат дека GA е присутна во повисоки концентрации во IPR клетките кои се наоѓаат најблиску до границата на органот. Ова сугерира дека моделот на SAM GA сигналната активност е резултат и од диференцијалната експресија на GA рецепторите и од диференцијалната акумулација на GA во IPR клетките во близина на границите на органите. Така, нашата анализа откри неочекуван просторновременски модел на GA сигнализација, со пониска активност во центарот и примордиумот на SAM и повисока активност во IPR во периферниот регион.
За да ја разбереме улогата на диференцијалната сигнална активност на GA во SAM, ја анализиравме корелацијата помеѓу активноста на сигнализација GA, проширувањето на клетките и клеточната делба користејќи сликање со временско застарување во реално време на SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Со оглед на улогата на GA во регулацијата на растот, се очекуваше позитивна корелација со параметрите за клеточна експанзија. Затоа, прво ги споредивме картите на сигналната активност на GA со мапи на стапката на раст на клеточната површина (како прокси за јачината на клеточното проширување за дадена клетка и за ќерките клетки при делба) и со мапи на анизотропија на растот, што ја мери насоченоста на клеточната експанзија (исто така се користи овде за дадена клетка и за ќерки клетки при делење; Сл. Нашите карти на стапката на раст на површината на САМ на клетките се конзистентни со претходните набљудувања38,39, со минимални стапки на раст на границата и максимални стапки на раст кај цветовите во развој (сл. 5а). Анализата на главна компонента (PCA) покажа дека активноста на сигнализацијата на GA е негативно поврзана со интензитетот на раст на клеточната површина (Слика 5в). Исто така, покажавме дека главните оски на варијација, вклучувајќи го влезот на сигналот GA и интензитетот на раст, беа ортогонални на насоката одредена со високата експресија на CLV3, потврдувајќи го исклучувањето на клетките од центарот SAM во преостанатите анализи. Спирмановата корелација анализа ги потврди резултатите од PCA (слика 5г), што покажува дека повисоките GA сигнали во IPR не резултирале со поголема клеточна експанзија. Сепак, анализата на корелација откри мала позитивна корелација помеѓу GA сигналната активност и анизотропијата на растот (слика 5в, г), што сугерира дека повисоката GA сигнализација во IPR влијае на насоката на клеточниот раст и евентуално на позицијата на рамнината на клеточната делба.
a, b Топлинските карти на просечниот површински раст (а) и анизотропијата на растот (б) во SAM се просечни во текот на седум независни постројки (кои се користат како прокси за јачината и насоката на клеточното проширување, соодветно). c PCA анализата ги вклучи следните променливи: GA сигнал, интензитет на раст на површината, анизотропија на површинскиот раст и CLV3 израз. Компонентата 1 на PCA беше главно негативна корелација со интензитетот на површинскиот раст и позитивно корелирана со GA сигналот. Компонентата 2 на PCA беше главно позитивна корелација со анизотропијата на површинскиот раст и негативна корелација со изразувањето на CLV3. Процентите ја претставуваат варијацијата објаснета со секоја компонента. г Спирманова корелација анализа помеѓу GA сигналот, интензитетот на површинскиот раст и анизотропијата на површинскиот раст на ткивната скала со исклучок на CZ. Бројот од десната страна е вредноста на Spearman rho помеѓу две променливи. Ѕвездичките означуваат случаи каде што корелацијата/негативната корелација е многу значајна. e 3D визуелизација на Col-0 SAM L1 клетките со конфокална микроскопија. Новите клеточни ѕидови формирани во SAM (но не и примордиумот) на 10 часа се обоени според нивните вредности на аголот. Лентата за боја е прикажана во долниот десен агол. Вметнувањето ја прикажува соодветната 3D слика на 0 ч. Експериментот беше повторен двапати со слични резултати. f Парцелите во кутии прикажуваат стапки на клеточна делба во IPR и non-IPR Col-0 SAM (n = 10 независни растенија). Централната линија ја покажува медијаната, а границите на кутијата ги означуваат 25-от и 75-тиот перцентил. Мустаќите ги означуваат минималните и максималните вредности утврдени со софтверот R. Вредностите на P се добиени со Велчовиот т-тест со две опашки. g, h Шематски дијаграм кој покажува (е) како да се измери аголот на новиот клеточен ѕид (магента) во однос на радијалната насока од центарот на SAM (бела точкаста линија) (се земаат предвид само вредностите на акутниот агол, т.е. 0-90°), и (ж) периферните/страничните и радијалните насоки во меристемот. i. Вредностите на P се добиени со двоопашки тест Колмогоров-Смирнов. Експериментот беше повторен двапати со слични резултати. j. Вредностите на P се добиени со двоопашки тест Колмогоров-Смирнов. Експериментот беше повторен двапати со слични резултати.
Затоа, следно ја истражувавме корелацијата помеѓу GA сигнализацијата и активноста на клеточната делба со идентификување на новоформираните клеточни ѕидови за време на анализата (сл. 5e). Овој пристап ни овозможи да ја измериме фреквенцијата и насоката на клеточната делба. Изненадувачки, откривме дека фреквенцијата на клеточни поделби во IPR и остатокот од SAM (не-IPR, Сл. 5f) беше слична, што покажува дека разликите во GA сигнализацијата помеѓу IPR и non-IPR клетките не влијаат значително на клеточната делба. Ова, и позитивната корелација помеѓу GA сигнализацијата и анизотропијата на раст, нè поттикна да размислиме дали активноста на сигнализација GA може да влијае на ориентацијата на рамнината на клеточната делба. Ја измеривме ориентацијата на новиот клеточен ѕид како остар агол во однос на радијалната оска што го поврзува центарот на меристемот и центарот на новиот клеточен ѕид (слика 5e-i) и забележавме јасна тенденција клетките да се делат под агли блиску до 90° во однос на радијалната оска, при што највисоките фреквенции се забележани на 80° и 703-80° (70%). (22,62%) (сл. 5e,i), што одговара на клеточните поделби во периферен/попречен правец (сл. 5h). За да го испитаме придонесот на GA сигнализацијата за ова однесување на клеточната делба, ги анализиравме параметрите на клеточната делба во IPR и не-IPR одделно (сл. 5i). Забележавме дека дистрибуцијата на аголот на делење во ќелиите на ИПР се разликува од онаа кај ќелиите што не се ИПР или во ќелиите во целиот SAM, при што ќелиите на ИПР покажуваат поголем дел од странични/кружни клеточни поделби, т.е., 70-80° и 80-90° (33,86% и 30,71%, соодветно) (слика 5, соодветно). Така, нашите набљудувања открија поврзаност помеѓу високата GA сигнализација и ориентацијата на рамнината на делба на клетките блиску до периферната насока, слична на корелацијата помеѓу сигналната активност на GA и анизотропијата на растот (сл. 5c, d). За понатамошно воспоставување на просторното зачувување на оваа асоцијација, ја измеривме ориентацијата на рамнината на поделба во ќелиите на IPR што го опкружуваат примордиумот почнувајќи од P3, бидејќи највисоката сигнална активност на GA беше откриена во овој регион почнувајќи од P4 (сл. 4). Аглите на поделба на IPR околу P3 и P4 не покажаа статистички значајни разлики, иако зголемена фреквенција на странични клеточни поделби беше забележана во IPR околу P4 (сл. 5j). Меѓутоа, во IPR ќелиите околу P5, разликата во ориентацијата на рамнината на клеточната делба стана статистички значајна, со нагло зголемување на фреквенцијата на попречните клеточни делби (сл. 5j). Заедно, овие резултати сугерираат дека GA сигнализацијата може да ја контролира ориентацијата на клеточните поделби во SAM, што е во согласност со претходните извештаи40,41 дека високата GA сигнализација може да предизвика странична ориентација на клеточните поделби во IPR.
Се предвидува дека клетките во ИПР нема да бидат инкорпорирани во примордија, туку во интерноди2,42,43. Попречната ориентација на клеточните поделби во ИПР може да резултира со типична организација на паралелни надолжни редови на епидермални клетки во интерноди. Нашите набљудувања опишани погоре сугерираат дека GA сигнализацијата најверојатно игра улога во овој процес со регулирање на насоката на клеточната делба.
Губењето на функцијата на неколку гени на DELLA резултира со конститутивен GA одговор, а della мутантите може да се користат за тестирање на оваа хипотеза44. Прво ги анализиравме моделите на изразување на пет DELLA гени во SAM. Транскрипциската фузија на линијата GUS45 откри дека GAI, RGA, RGL1 и RGL2 (во многу помала мера) се изразени во SAM (Дополнителна слика 11a-d). In situ хибридизацијата дополнително покажа дека GAI mRNA се акумулира конкретно во примордијата и во цветовите во развој (Дополнителна слика 11e). RGL1 и RGL3 mRNA беа откриени низ SAM крошната и кај постарите цветови, додека RGL2 mRNA беше позастапена во пограничниот регион (Дополнителна слика 11f-h). Конфокалното сликање на pRGL3::RGL3-GFP SAM го потврди изразот забележан со in situ хибридизација и покажа дека протеинот RGL3 се акумулира во централниот дел на SAM (Дополнителна слика 11i). Користејќи ја линијата pRGA::GFP-RGA, откривме и дека RGA протеинот се акумулира во SAM, но неговото изобилство се намалува на границата почнувајќи од P4 (Дополнителна слика 11j). Имено, шемите на изразување на RGL3 и RGA се конзистентни со повисоката GA сигнална активност во IPR, како што е откриено од qmRGA (сл. 4). Покрај тоа, овие податоци покажуваат дека сите DELLA се изразени во SAM и дека нивниот израз колективно го опфаќа целиот SAM.
Потоа ги анализиравме параметрите на клеточната делба во дивиот тип SAM (Ler, контрола) и gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della петкратни (глобални) мутанти (сл. 6а, б). Интересно, забележавме статистички значајно поместување во распределбата на фреквенциите на аголот на поделба на клетките во della глобалниот мутант SAM во споредба со дивиот тип (сл. 6в). Оваа промена во della глобалниот мутант се должи на зголемувањето на фреквенцијата на аглите од 80-90° (34,71% наспроти 24,55%) и, во помала мера, аглите од 70-80° (23,78% наспроти 20,18%), т.е., што одговара на попречните клеточни делби (сл.6c). Фреквенцијата на не-попречни поделби (0-60°) исто така беше помала кај della глобалниот мутант (сл. 6c). Фреквенцијата на попречните клеточни делби беше значително зголемена во SAM на della глобалниот мутант (сл. 6б). Фреквенцијата на попречните клеточни поделби во ИПР беше исто така повисока кај della глобалниот мутант во споредба со дивиот тип (сл. 6d). Надвор од регионот на IPR, дивиот тип имаше порамномерна распределба на аглите на клеточната делба, додека della глобалниот мутант претпочита тангенцијални поделби како што е IPR (сл. 6e). Ние, исто така, ја квантифициравме ориентацијата на клеточните поделби во SAM на ga2 оксидаза (ga2ox) петкратни мутанти (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 и ga2ox6-2), GA-неактивна мутантна позадина во која GA се акумулира. Во согласност со зголемувањето на нивоата на GA, SAM на петкратниот ga2ox мутант соцвети беше поголем од оној на Col-0 (Дополнителна слика 12a, b), и во споредба со Col-0, петкратниот ga2ox SAM покажа изразито различна дистрибуција на аглите на фреквенцијата на клетката, при што аголот повторно се зголемуваше од 9° до 50°. поделби (Дополнителна слика 12а–в). Така, покажуваме дека конститутивното активирање на сигнализацијата на ГА и акумулацијата на ГА предизвикуваат латерални клеточни поделби во ИПР и остатокот од САМ.
a, b 3D визуелизација на L1 слојот на PI-обоен Ler (а) и глобален della мутант (b) SAM со помош на конфокална микроскопија. Новите клеточни ѕидови формирани во SAM (но не и примордиумот) во период од 10 часа се прикажани и обоени според нивните вредности на аголот. Вметнувањето го прикажува SAM на 0 ч. Лентата со бои се прикажува во долниот десен агол. Стрелката во (б) укажува на пример на подредени клеточни датотеки во глобалниот дела мутант. Експериментот беше повторен двапати со слични резултати. ce споредба на фреквентната дистрибуција на ориентации на рамнината на делба на клетките во целиот SAM (d), IPR (e) и не-IPR (f) помеѓу Ler и глобалната della. Вредностите на P се добиени со помош на двоопашки тест Колмогоров-Смирнов. f, g 3D визуелизација на конфокални слики на PI-обоени SAM на Col-0 (i) и pCUC2::gai-1-VENUS (j) трансгенски растенија. Панелите (а, б) покажуваат нови клеточни ѕидови (но не и примордија) формирани во SAM во рок од 10 часа. Експериментот беше повторен двапати со слични резултати. h–j Споредба на фреквентната дистрибуција на ориентации на рамнината на делба на клетките лоцирани во целиот SAM (h), IPR (i) и non-IPR (j) помеѓу растенијата Col-0 и pCUC2::gai-1-VENUS. Вредностите на P се добиени со помош на тест со две опашки Колмогоров-Смирнов.
Следно го тестиравме ефектот на инхибиција на GA сигнализација конкретно во IPR. За таа цел, го користевме промоторот на котиледонската чаша 2 (CUC2) за да поттикнеме изразување на доминантен негативен протеин gai-1 споен со VENUS (во линијата pCUC2::gai-1-VENUS). Во SAM од див тип, промоторот CUC2 ја поттикнува експресијата на повеќето IPR во SAM, вклучувајќи ги и граничните ќелии, од P4 наваму, а слична специфична експресија беше забележана кај растенијата pCUC2::gai-1-VENUS (види подолу). Распределбата на аглите на клеточната делба низ SAM или IPR на растенијата pCUC2::gai-1-VENUS не беше значително различна од онаа на дивиот тип, иако неочекувано откривме дека клетките без IPR кај овие растенија се делат на повисока фреквенција од 80-90° (сл. 6f-j).
Предложено е дека насоката на клеточната делба зависи од геометријата на SAM, особено од стресот на истегнување генериран од искривувањето на ткивото46. Затоа, прашавме дали обликот на SAM е променет кај della глобалниот мутант и pCUC2::gai-1-VENUS растенијата. Како што беше објавено претходно12, големината на della глобалниот мутант SAM беше поголема од онаа на дивиот тип (Дополнителна слика 13a, b, d). In situ хибридизацијата на CLV3 и STM РНК ја потврди меристемската експанзија кај дела мутанти и дополнително ја покажа латералната експанзија на нишата на матичните клетки (Дополнителна слика 13e, f, h, i). Сепак, кривината на SAM беше слична кај двата генотипа (Дополнителна слика 13k, m, n, p). Забележавме слично зголемување на големината кај четирикратниот мутант gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della без промена на закривеноста во споредба со дивиот тип (Дополнителна слика 13c, d, g, j, l, o, p). Фреквенцијата на ориентацијата на клеточната делба исто така беше засегната кај della четворократниот мутант, но во помала мера отколку кај della монолитниот мутант (Дополнителна слика 12d-f). Овој ефект на дозирање, заедно со недостатокот на ефект врз заобленоста, сугерира дека преостанатата активност на RGL3 во четирикратниот мутант Della ги ограничува промените во ориентацијата на клеточната делба предизвикана од губење на активноста на DELLA и дека промените во страничните клеточни поделби се јавуваат како одговор на промените во сигналната активност на GA наместо промените во геометријата на SAM. Како што е опишано погоре, промоторот CUC2 го поттикнува изразувањето на IPR во SAM почнувајќи од P4 (Дополнителна слика 14а, б), а за разлика од тоа, pCUC2::gai-1-VENUS SAM имаше намалена големина, но поголема закривеност (Дополнителна слика 14c–h). Оваа промена во pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологијата може да резултира со различна распределба на механичките напрегања во споредба со дивиот тип, во кој високите периферни напони започнуваат на пократко растојание од SAM центарот47. Алтернативно, промените во pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологијата може да резултираат од промените во регионалните механички својства предизвикани од трансгенската експресија48. Во двата случаи, ова може делумно да ги неутрализира ефектите од промените во GA сигнализацијата со зголемување на веројатноста клетките да се поделат во периферната/попречната ориентација, објаснувајќи ги нашите набљудувања.
Земени заедно, нашите податоци потврдуваат дека повисоката GA сигнализација игра активна улога во страничната ориентација на рамнината на клеточната делба во IPR. Тие исто така покажуваат дека кривината на меристемот, исто така, влијае на ориентацијата на рамнината на клеточната делба во IPR.
Попречната ориентација на рамнината на поделба во IPR, поради високата GA сигнална активност, сугерира дека GA претходно организира радијална клеточна датотека во епидермисот во рамките на SAM за да ја дефинира клеточната организација што подоцна ќе се најде во епидермалната интернода. Навистина, таквите клеточни датотеки беа често видливи во SAM сликите на della глобалните мутанти (сл. 6б). Така, за понатамошно истражување на развојната функција на просторниот модел на GA сигнализација во SAM, користевме временско снимање за да ја анализираме просторната организација на клетките во IPR кај дивиот тип (Ler и Col-0), della глобалните мутанти и pCUC2::gai-1-VENUS трансгенските растенија.
Откривме дека qmRGA покажа дека GA сигналната активност во IPR се зголеми од P1/P2 и го достигна врвот на P4, а оваа шема остана константна со текот на времето (сл. 4a-f и дополнителна слика 8c-f, k). За да ја анализираме просторната организација на клетките во ИПР со зголемен GA сигнал, ги означивме Ler IPR клетките горе и на страните на P4 според нивната развојна судбина анализирана 34 часа по првото набљудување, т.е. повеќе од два пати пластидна, што ни овозможува да ги следиме IPR клетките за време на развојот на примордиумот од P1/P2 до P4. Користивме три различни бои: жолта за оние ќелии кои беа интегрирани во примордиумот во близина на P4, зелена за оние кои беа во IPR и виолетова за оние кои учествуваа во двата процеси (сл. 7а-в). На t0 (0 ч), 1-2 слоја на IPR ќелии беа видливи пред P4 (сл. 7а). Како што се очекуваше, кога овие клетки се поделија, тие го правеа тоа главно преку попречната рамнина на делба (сл. 7а-в). Слични резултати беа добиени со користење на Col-0 SAM (фокусирајќи се на P3, чија граница се превиткува слично на P4 во Лер), иако во овој генотип наборот формиран на цветната граница побрзо ги криеше IPR клетките (сл. 7g-i). Така, моделот на поделба на ќелиите на IPR ги предорганизира клетките во радијални редови, како кај интернодите. Организацијата на радијалните редови и локализацијата на IPR клетките помеѓу последователните органи сугерираат дека овие клетки се меѓунодални прогенитори.
Овде, развивме ратиометриски биосензор за сигнализација GA, qmRGA, кој овозможува квантитативно мапирање на сигналната активност на GA што произлегува од комбинираните концентрации на рецепторите на GA и GA, додека ги минимизираме пречките со ендогените сигнални патишта, а со тоа обезбедува информации за функцијата на GA на клеточно ниво. За таа цел, конструиравме модифициран DELLA протеин, mRGA, кој ја изгуби способноста да ги врзува партнерите за интеракција на DELLA, но останува чувствителен на протеолиза индуцирана од GA. qmRGA реагира и на егзогени и на ендогени промени во нивоата на GA, а неговите динамични особини на сензори овозможуваат проценка на просторновременските промени во сигналната активност на GA за време на развојот. qmRGA е исто така многу флексибилна алатка бидејќи може да се прилагоди на различни ткива со менување на промоторот што се користи за неговото изразување (доколку е потребно), а со оглед на зачуваната природа на сигналната патека GA и мотивот PFYRE низ ангиоспермите, веројатно е дека може да се пренесе на други видови22. Во согласност со ова, се покажа дека еквивалентна мутација во оризот SLR1 DELLA протеин (HYY497AAA) ја потиснува активноста на репресорот на растот на SLR1 додека само малку ја намалува неговата деградација посредувана од GA, слично на mRGA23. Имено, неодамнешните студии во Arabidopsis покажаа дека една мутација на една аминокиселина во доменот PFYRE (S474L) ја промени транскрипциската активност на RGA без да влијае на неговата способност да комуницира со партнерите на транскрипциониот фактор50. Иако оваа мутација е многу блиску до 3-те замени на аминокиселини присутни во mRGA, нашите студии покажуваат дека овие две мутации ги менуваат различните карактеристики на DELLA. Иако повеќето партнери на факторот на транскрипција се врзуваат за LHR1 и SAW домените на DELLA26,51, некои конзервирани амино киселини во доменот PFYRE може да помогнат да се стабилизираат овие интеракции.
Развојот на интерноди е клучна карактеристика во архитектурата на растенијата и подобрувањето на приносот. qmRGA откри повисока GA сигнална активност во IPR интернодните прогениторни клетки. Со комбинирање на квантитативното сликање и генетиката, покажавме дека шемите на сигнализација GA ги наметнуваат кружните/попречните рамнини на клеточната делба во епидермисот SAM, обликувајќи ја организацијата на клеточната делба потребна за развој на интерноди. Во текот на развојот се идентификувани неколку регулатори на ориентацијата на рамнината на делба на клетките52,53. Нашата работа дава јасен пример за тоа како GA сигналната активност го регулира овој клеточен параметар. DELLA може да стапи во интеракција со превиткувачки протеински комплекси41, така што GA сигнализацијата може да ја регулира ориентацијата на рамнината на клеточната делба со директно влијание врз ориентацијата на кортикалните микротубули40,41,54,55. Неочекувано покажавме дека во SAM, корелацијата на повисоката сигнална активност на GA не беше издолжување или поделба на клетките, туку само анизотропија на растот, што е во согласност со директниот ефект на GA врз насоката на клеточната делба во IPR. Сепак, не можеме да исклучиме дека овој ефект може да биде и индиректен, на пример, посредуван од омекнување на клеточниот ѕид предизвикано од ГА56. Промените во својствата на клеточниот ѕид предизвикуваат механички стрес57,58, кој исто така може да влијае на ориентацијата на рамнината на клеточната делба со тоа што влијае на ориентацијата на кортикалните микротубули39,46,59. Комбинираните ефекти од GA-индуцираниот механички стрес и директното регулирање на ориентацијата на микротубулите со GA може да бидат вклучени во генерирањето на специфичен модел на ориентација на клеточната делба во IPR за да се дефинираат интерноди, а потребни се дополнителни студии за да се тестира оваа идеја. Слично на тоа, претходните студии ја истакнаа важноста на протеините TCP14 и 15 кои стапуваат во интеракција со DELLA во контролата на формирањето на меѓујазлите60,61 и овие фактори може да посредуваат во дејството на GA заедно со BREVIPEDICELLUS (BP) и PENNYWISE (PNY), кои го регулираат развојот на меѓујазлите и се покажа дека влијаат на GA2 сигналот2. Со оглед на тоа дека DELLA-ите комуницираат со сигналните патишта на брасиностероид, етилен, јасмонска киселина и апсцизинска киселина (ABA)63,64 и дека овие хормони можат да влијаат на ориентацијата на микротубулите65, ефектите на GA врз ориентацијата на клеточната делба може да бидат посредувани и од други хормони.
Раните цитолошки студии покажаа дека и внатрешниот и надворешниот регион на Arabidopsis SAM се потребни за развој на интерноди2,42. Фактот дека ГА активно ја регулира клеточната делба во внатрешните ткива12 поддржува двојна функција на ГА во регулирањето на големината на меристемот и интернодот во САМ. Моделот на насочена клеточна делба е исто така цврсто регулиран во внатрешното ткиво на SAM, и оваа регулација е од суштинско значење за растот на стеблото52. Ќе биде интересно да се испита дали GA исто така игра улога во ориентирањето на рамнината на клеточната делба во внатрешната организација на SAM, а со тоа ги синхронизира спецификацијата и развојот на интерноди во рамките на SAM.
Растенијата беа одгледувани in vitro во почва или 1x Murashige-Skoog (MS) медиум (Duchefa) дополнет со 1% сахароза и 1% агар (Sigma) под стандардни услови (16 часа светлина, 22 °C), освен за експерименти со хипокотил и раст на коренот во кои садници се одгледуваа на вертикални плочи 22 °C под постојана светлина. За експерименти со нитрати, растенијата беа одгледувани на модифицирана MS средина (биоСВЕТ растителна средина) дополнета со адекватен нитрат (0 или 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-сукцинат, 1% сахароза и 1% А-агар (Sigma) под долги дневни услови.
GID1a cDNA вметната во pDONR221 беше рекомбинирана со pDONR P4-P1R-pUBQ10 и pDONR P2R-P3-mCherry во pB7m34GW за да се генерира pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 ДНК вметната во pDONR221 беше рекомбинирана во pB7RWG266 за да се генерира p35S:IDD2-RFP. За да се генерира pGID1b::2xmTQ2-GID1b, фрагмент од 3,9 kb спротиводно од кодниот регион GID1b и фрагмент од 4,7 kb што ги содржи GID1b cDNA (1,3 kb) и терминаторот (3,4 kb) прво беа засилени со користење на прајмерите во Дополнителната табела, потоа наведена во табела ONR4 и p3D. Fisher Scientific) и pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), соодветно, и на крајот рекомбинирани со pDONR221 2xmTQ268 во целниот вектор pGreen 012567 користејќи клонирање на портал. За да се генерира pCUC2:: LSSmOrange, промотерската секвенца CUC2 (3229 bp возводно од ATG) проследена со шифрирана секвенца на големиот мОранж преместен од Стоукс (LSSmOrange)69 со сигналот за нуклеарна локализација N7 и NOS транскрипцискиот терминатор беше склопен со користење на таргетираниот G vecinamy. Систем за рекомбинација со 3 фрагменти (Инвитроген). Растителниот бинарен вектор беше воведен во сојот Agrobacterium tumefaciens GV3101 и воведен во листовите Nicotiana benthamiana со методот на инфилтрација на Agrobacterium и во Arabidopsis thaliana Col-0 со методот floral dip, соодветно. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry и pCLV3::mCherry-NLS qmRGA беа изолирани од F3 и F1 потомците на соодветните вкрстувања, соодветно.
РНК in situ хибридизацијата беше изведена на врвови долги околу 1 cm72, кои беа собрани и веднаш фиксирани во раствор на FAA (3,7% формалдехид, 5% оцетна киселина, 50% етанол) претходно ладен до 4 °C. По 2 × 15 мин вакуумски третмани, фиксаторот беше сменет и примероците беа инкубирани преку ноќ. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 и RGL3 cDNA и антисенс сонди за нивните 3'-UTR беа синтетизирани со користење на прајмери прикажани во Дополнителна табела 3 како што е опишано од Rosier et al.73. Сондите означени со дигоксигенин беа имунооткриени со користење на антитела на дигоксигенин (3000 пати разредување; Roche, каталошки број: 11 093 274 910), а деловите беа обоени со 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP/00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000), а деловите беа обоени со 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP) (NBT, 200-кратно разредување) раствор.
Време на објавување: Февруари 10-2025