Растот на апикалниот меристем (SAM) на изданокот е клучен за архитектурата на стеблото. Растителни хормони на растенијата.гиберелини(GA) играат клучна улога во координирањето на растот на растенијата, но нивната улога во SAM останува слабо разбрана. Овде, развивме ратиометриски биосензор за GA сигнализација со инженерство на протеинот DELLA за да ја потиснеме неговата суштинска регулаторна функција во транскрипцискиот одговор на GA, а воедно да ја зачуваме неговата деградација по препознавањето на GA. Покажуваме дека овој биосензор базиран на деградација точно ги евидентира промените во нивоата на GA и клеточното сензорирање за време на развојот. Го користевме овој биосензор за мапирање на активноста на GA сигнализацијата во SAM. Покажуваме дека високите GA сигнали се присутни претежно во клетките лоцирани помеѓу примордиите на органите, кои се претходници на клетките на интернодот. Користејќи пристапи на добивање и губење на функцијата, дополнително покажуваме дека GA ја регулира ориентацијата на рамнината на клеточната делба, воспоставувајќи ја каноничната клеточна организација на интернодите, со што се промовира спецификацијата на интернодот во SAM.
Апикалниот меристем на изданокот (SAM), сместен на врвот на изданокот, содржи ниша од матични клетки чија активност генерира латерални органи и матични јазли на модуларен и итеративен начин во текот на целиот живот на растението. Секоја од овие повторувачки единици, или растителни јазли, вклучува интерноди и латерални органи на јазлите, и аксиларни меристеми во оските на листовите1. Растот и организацијата на растителните јазли се менуваат за време на развојот. Кај Arabidopsis, интернодалниот раст е потиснат за време на вегетативната фаза, а аксиларните меристеми остануваат неактивни во оските на листовите во форма на розета. За време на транзицијата кон цветната фаза, SAM станува меристем на инфлоресценција, генерирајќи издолжени интерноди и аксиларни пупки, гранчиња во оските на листовите од карпата, а подоцна, безлисни цветови2. Иако постигнавме значителен напредок во разбирањето на механизмите што ја контролираат иницијацијата на лисјата, цветовите и гранките, релативно малку се знае за тоа како се јавуваат интернодите.
Разбирањето на просторно-временската дистрибуција на GA ќе помогне подобро да се разберат функциите на овие хормони во различни ткива и во различни фази на развој. Визуелизацијата на деградацијата на фузијата RGA-GFP експресирана под дејство на сопствениот промотор дава важни информации за регулирањето на вкупните нивоа на GA во корените15,16. Сепак, експресијата на RGA варира низ ткивата17 и е регулирана од GA18. Така, диференцијалната експресија на промоторот RGA може да резултира со флуоресцентен модел забележан со RGA-GFP и затоа овој метод не е квантитативен. Неодамна, биоактивниот флуоресцеин (Fl) обележан GA19,20 откри акумулација на GA во ендокортексот на коренот и регулирање на неговите клеточни нивоа преку GA транспорт. Неодамна, GA FRET сензорот nlsGPS1 покажа дека нивоата на GA корелираат со издолжувањето на клетките во корените, филаментите и темнорастените хипокотили21. Сепак, како што видовме, концентрацијата на GA не е единствениот параметар што ја контролира активноста на GA сигнализација, бидејќи зависи од сложените процеси на сензорирање. Тука, надоградувајќи се на нашето разбирање на DELLA и GA сигналните патишта, го објавуваме развојот и карактеризацијата на ратиометриски биосензор базиран на деградација за GA сигнализација. За да го развиеме овој квантитативен биосензор, користевме мутант GA-сензитивен RGA кој беше споен со флуоресцентен протеин и сеприсутно експресиран во ткивата, како и GA-нечувствителен флуоресцентен протеин. Покажуваме дека мутантните RGA протеински фузии не се мешаат во ендогената GA сигнализација кога е сеприсутно експресирана и дека овој биосензор може да квантифицира сигнална активност што произлегува од влезот на GA и обработката на GA сигналот од страна на сензорскиот апарат со висока просторно-временска резолуција. Го користевме овој биосензор за да ја мапираме просторно-временската дистрибуција на GA сигналната активност и да квантифицираме како GA го регулира клеточното однесување во SAM епидермисот. Покажуваме дека GA ја регулира ориентацијата на рамнината на поделбата на SAM клетките лоцирани помеѓу примордиите на органите, со што ја дефинираме каноничната клеточна организација на интернодот.
Конечно, прашавме дали qmRGA може да пријави промени во ендогените нивоа на GA користејќи растечки хипокотили. Претходно покажавме дека нитратот го стимулира растот со зголемување на синтезата на GA и, пак, деградацијата на DELLA34. Според тоа, забележавме дека должината на хипокотилот кај садниците pUBQ10::qmRGA одгледувани под изобилство на нитрати (10 mM NO3−) беше значително подолга од онаа кај садниците одгледувани под услови на недостаток на нитрати (Дополнителна слика 6а). Во согласност со одговорот на растот, GA сигналите беа повисоки кај хипокотилите на садници одгледувани под услови на 10 mM NO3− отколку кај садниците одгледувани во отсуство на нитрат (Дополнителна слика 6б, в). Така, qmRGA исто така овозможува следење на промените во GA сигнализацијата предизвикани од ендогени промени во концентрацијата на GA.
За да разбереме дали активноста на GA сигнализација детектирана од qmRGA зависи од концентрацијата на GA и перцепцијата на GA, како што се очекуваше врз основа на дизајнот на сензорот, ја анализиравме експресијата на трите GID1 рецептори во вегетативните и репродуктивните ткива. Кај садниците, репортерската линија GID1-GUS покажа дека GID1a и c се високо експресирани во котиледоните (Сл. 3a–c). Покрај тоа, сите три рецептори беа експресирани во лисјата, страничните коренски примордија, врвовите на коренот (освен коренската капа на GID1b) и васкуларниот систем (Сл. 3a–c). Во SAM со инфлоресценција, детектиравме GUS сигнали само за GID1b и 1c (Дополнителна слика 7a–c). In situ хибридизацијата ги потврди овие модели на експресија и дополнително покажа дека GID1c е рамномерно експресиран на ниски нивоа во SAM, додека GID1b покажува поголема експресија на периферијата на SAM (Дополнителна слика 7d–l). Транслациската фузија pGID1b::2xmTQ2-GID1b, исто така, откри градуиран опсег на експресија на GID1b, од ниска или никаква експресија во центарот на SAM до висока експресија на границите на органите (Дополнителна слика 7m). Така, GID1 рецепторите не се рамномерно распределени низ и во ткивата. Во последователните експерименти, исто така, забележавме дека прекумерната експресија на GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ја зголеми чувствителноста на qmRGA кај хипокотилите на надворешна апликација на GA (Сл. 3d, e). Спротивно на тоа, флуоресценцијата измерена со qd17mRGA во хипокотилот беше нечувствителна на третман со GA3 (Сл. 3f, g). За двата теста, садниците беа третирани со високи концентрации на GA (100 μM GA3) за да се процени брзото однесување на сензорот, каде што способноста за врзување за GID1 рецепторот беше зголемена или изгубена. Заедно, овие резултати потврдуваат дека qmRGA биосензорот служи комбинирана функција како GA и GA сензор и сугерираат дека диференцијалната експресија на GID1 рецепторот може значително да ја модулира емисивноста на сензорот.
До денес, дистрибуцијата на GA сигналите во SAM останува нејасна. Затоа, користевме растенија што експресираат qmRGA и репортерот на матични клетки pCLV3::mCherry-NLS35 за да пресметаме квантитативни мапи со висока резолуција на активноста на GA сигнализацијата, фокусирајќи се на слојот L1 (епидермис; Сл. 4a, b, видете Методи и дополнителни методи), бидејќи L1 игра клучна улога во контролирањето на растот на SAM36. Тука, експресијата pCLV3::mCherry-NLS обезбеди фиксна геометриска референтна точка за анализа на просторно-временската дистрибуција на активноста на GA сигнализацијата37. Иако GA се смета за суштински за развој на латералните органи4, забележавме дека GA сигналите беа ниски во цветниот примордиум (P) почнувајќи од фазата P3 (Сл. 4a, b), додека младите P1 и P2 примордиуми имаа умерена активност слична на онаа во централниот регион (Сл. 4a, b). Повисока активност на GA сигнализација беше откриена на границите на примордиумот на органите, почнувајќи од P1/P2 (на страните од границата) и достигнувајќи врв на P4, како и во сите клетки од периферниот регион лоциран помеѓу примордиите (Сл. 4a, b и Дополнителна слика 8a, b). Оваа повисока активност на GA сигнализација беше забележана не само во епидермисот, туку и во слоевите L2 и горните L3 (Дополнителна слика 8b). Моделот на GA сигнали детектирани во SAM користејќи qmRGA исто така остана непроменет со текот на времето (Дополнителна слика 8c–f, k). Иако конструкцијата qd17mRGA беше систематски намалена во SAM на растенијата Т3 од пет независни линии што ги карактеризиравме детално, бевме во можност да ги анализираме флуоресцентните модели добиени со конструкцијата pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Дополнителна слика 8g–j, l). Во оваа контролна линија, во SAM беа откриени само мали промени во односот на флуоресценција, но во SAM центарот забележавме јасно и неочекувано намалување на VENUS поврзано со TagBFP. Ова потврдува дека сигналниот модел забележан од qmRGA одразува GA-зависна деградација на mRGA-VENUS, но исто така покажува дека qmRGA може да ја прецени GA сигналната активност во меристемскиот центар. Накратко, нашите резултати откриваат GA сигнален модел кој првенствено ја одразува дистрибуцијата на примордијалите. Оваа дистрибуција на интер-примордијалниот регион (IPR) се должи на постепеното воспоставување на висока GA сигнална активност помеѓу примордијалот во развој и централниот регион, додека во исто време GA сигналната активност во примордијалот се намалува (Сл. 4c, d).
Распределбата на GID1b и GID1c рецепторите (видете погоре) сугерира дека диференцијалната експресија на GA рецепторите помага во обликувањето на моделот на GA сигнализирачката активност во SAM. Се прашувавме дали може да биде вклучена диференцијална акумулација на GA. За да ја испитаме оваа можност, го користевме nlsGPS1 GA FRET сензорот21. Зголемена фреквенција на активирање беше откриена во SAM на nlsGPS1 третиран со 10 μM GA4+7 во тек на 100 минути (Дополнителна слика 9a-e), што укажува дека nlsGPS1 реагира на промените во концентрацијата на GA во SAM, како што прави во корените21. Просторната распределба на фреквенцијата на активирање на nlsGPS1 откри релативно ниски нивоа на GA во надворешните слоеви на SAM, но покажа дека тие се покачени во центарот и на границите на SAM (Слика 4e и Дополнителна слика 9a,c). Ова сугерира дека GA е исто така дистрибуиран во SAM со просторен модел споредлив со оној откриен од qmRGA. Како комплементарен пристап, го третиравме SAM и со флуоресцентен GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) или само со Fl како негативна контрола. Сигналот Fl беше дистрибуиран низ целиот SAM, вклучувајќи го централниот регион и примордиумот, иако со помал интензитет (Сл. 4j и Дополнителна слика 10d). Спротивно на тоа, сите три GA-Fl се акумулираа специфично во границите на примордиумот и во различен степен во остатокот од IPR, при што GA7-Fl се акумулираше во најголемиот домен во IPR (Сл. 4k и Дополнителна слика 10a,b). Квантификацијата на интензитетот на флуоресценција покажа дека односот на интензитетот на IPR кон не-IPR беше поголем кај SAM третиран со GA-Fl во споредба со SAM третиран со Fl (Сл. 4l и Дополнителна слика 10c). Заедно, овие резултати сугерираат дека GA е присутен во повисоки концентрации во IPR клетките кои се наоѓаат најблиску до границата на органите. Ова укажува дека моделот на активноста на сигнализацијата на SAM GA е резултат и на диференцијална експресија на GA рецепторите и на диференцијална акумулација на GA во IPR клетките во близина на границите на органите. Така, нашата анализа откри неочекуван просторно-временски модел на сигнализацијата на GA, со помала активност во центарот и примордиумот на SAM и поголема активност во IPR во периферниот регион.
За да ја разбереме улогата на диференцијалната GA сигнална активност во SAM, ја анализиравме корелацијата помеѓу GA сигналната активност, експанзијата на клетките и клеточната делба користејќи снимање во реално време на SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Со оглед на улогата на GA во регулацијата на растот, се очекуваше позитивна корелација со параметрите на експанзија на клетките. Затоа, прво ги споредивме мапите на GA сигналната активност со мапите на стапката на раст на површината на клетките (како замена за јачината на експанзијата на клетките за дадена клетка и за ќерките клетки при делба) и со мапите на анизотропија на раст, која ја мери насоченоста на експанзијата на клетките (исто така користена овде за дадена клетка и за ќерките клетки при делба; Сл. 5a,b, видете Методи и дополнителни методи). Нашите мапи на стапката на раст на површината на клетките на SAM се во согласност со претходните набљудувања38,39, со минимални стапки на раст на границата и максимални стапки на раст кај цветовите во развој (Сл. 5a). Анализата на главните компоненти (PCA) покажа дека GA сигналната активност е негативно поврзана со интензитетот на раст на површината на клетките (Слика 5c). Исто така, покажавме дека главните оски на варијација, вклучувајќи го влезот на GA сигнализација и интензитетот на раст, беа ортогонални на насоката одредена од високата експресија на CLV3, потврдувајќи го исклучувањето на клетките од SAM центарот во преостанатите анализи. Корелациската анализа на Спирман ги потврди резултатите од PCA (Слика 5d), што укажува дека повисоките GA сигнали во IPR не резултирале со поголема експанзија на клетките. Сепак, корелациската анализа откри мала позитивна корелација помеѓу активноста на GA сигнализација и анизотропијата на раст (Слика 5c, d), што укажува дека повисоката GA сигнализација во IPR влијае на насоката на раст на клетките и евентуално на позицијата на рамнината на клеточната делба.
a, b Топлинските мапи на средниот површински раст (a) и анизотропијата на раст (b) во SAM се просечни за седум независни растенија (користени како показатели за силата и насоката на експанзија на клетките, соодветно). c PCA анализата ги вклучуваше следните варијабли: GA сигнал, интензитет на површински раст, анизотропија на површински раст и експресија на CLV3. PCA компонента 1 беше главно негативно корелирана со интензитетот на површинскиот раст и позитивно корелирана со GA сигналот. PCA компонента 2 беше главно позитивно корелирана со анизотропијата на површинскиот раст и негативно корелирана со експресијата на CLV3. Процентите ја претставуваат варијацијата објаснета од секоја компонента. d Спирманова корелациска анализа помеѓу GA сигналот, интензитетот на површинскиот раст и анизотропијата на површинскиот раст на ткивната скала, со исклучок на CZ. Бројот од десно е Spearman rho вредноста помеѓу две варијабли. Ѕвездичките означуваат случаи каде што корелацијата/негативната корелација е многу значајна. e 3D визуелизација на Col-0 SAM L1 клетки со конфокална микроскопија. Новите клеточни ѕидови формирани во SAM (но не и во примордиумот) на 10 часа се обоени според нивните вредности на аголот. Лентата со бои е прикажана во долниот десен агол. Вметнатиот дел ја прикажува соодветната 3D слика на 0 часа. Експериментот беше повторен двапати со слични резултати. f Графиконите во кутии ги прикажуваат стапките на клеточна делба во IPR и не-IPR Col-0 SAM (n = 10 независни растенија). Централната линија ја покажува медијаната, а границите на кутиите ги означуваат 25-тиот и 75-тиот перцентил. Мустаќите ги означуваат минималните и максималните вредности утврдени со софтверот R. P вредностите се добиени со двостран t-тест на Велч. g, h Шематски дијаграм што покажува (g) како да се измери аголот на новиот клеточен ѕид (магента) во однос на радијалната насока од центарот на SAM (бела испрекината линија) (се земаат предвид само вредностите на остриот агол, т.е. 0–90°) и (h) периферните/латералните и радијалните насоки во рамките на меристемот. i Фреквентни хистограми на ориентацијата на рамнината на клеточната делба низ SAM (темно сина), IPR (средно сина) и не-IPR (светло сина), соодветно. P вредностите се добиени со двостран Колмогоров-Смирнов тест. Експериментот е повторен двапати со слични резултати. j Фреквентни хистограми на ориентацијата на рамнината на клеточната делба на IPR околу P3 (светло зелена), P4 (средно зелена) и P5 (темно зелена), соодветно. P вредностите се добиени со двостран Колмогоров-Смирнов тест. Експериментот е повторен двапати со слични резултати.
Затоа, потоа ја испитавме корелацијата помеѓу GA сигнализацијата и активноста на клеточната делба со идентификување на новоформирани клеточни ѕидови за време на анализата (Сл. 5e). Овој пристап ни овозможи да ја измериме фреквенцијата и насоката на клеточната делба. Изненадувачки, откривме дека фреквенцијата на клеточните делби во IPR и остатокот од SAM (не-IPR, Сл. 5f) беше слична, што укажува дека разликите во GA сигнализацијата помеѓу IPR и не-IPR клетките не влијаат значително врз клеточната делба. Ова, и позитивната корелација помеѓу GA сигнализацијата и анизотропијата на раст, нè поттикнаа да разгледаме дали активноста на GA сигнализацијата може да влијае на ориентацијата на рамнината на клеточната делба. Ја измеривме ориентацијата на новиот клеточен ѕид како остар агол во однос на радијалната оска што ги поврзува центарот на меристемот и центарот на новиот клеточен ѕид (Сл. 5e-i) и забележавме јасна тенденција клетките да се делат под агли блиски до 90° во однос на радијалната оска, со највисоки фреквенции забележани на 70–80° (23,28%) и 80–90° (22,62%) (Сл. 5e,i), што одговара на клеточните поделби во кружна/попречна насока (Сл. 5h). За да го испитаме придонесот на GA сигнализацијата кон ова однесување на клеточната делба, ги анализиравме параметрите на клеточната делба во IPR и не-IPR одделно (Сл. 5i). Забележавме дека распределбата на аголот на делба во IPR клетките се разликува од онаа кај не-IPR клетките или во клетките во целиот SAM, при што IPR клетките покажуваат поголем процент на латерални/кружни клеточни поделби, т.е. 70–80° и 80–90° (33,86% и 30,71%, соодветно, соодветни пропорции) (Сл. 5i). Така, нашите набљудувања открија поврзаност помеѓу високата GA сигнализација и ориентацијата на рамнината на клеточната делба блиску до периферната насока, слично на корелацијата помеѓу активноста на GA сигнализација и анизотропијата на раст (Сл. 5c, d). За понатамошно утврдување на просторното зачувување на оваа поврзаност, ја измеривме ориентацијата на рамнината на делба во IPR клетките што го опкружуваат примордиумот почнувајќи од P3, бидејќи највисоката активност на GA сигнализација беше откриена во овој регион почнувајќи од P4 (Сл. 4). Аглите на делба на IPR околу P3 и P4 не покажаа статистички значајни разлики, иако беше забележана зголемена фреквенција на латерални клеточни поделби во IPR околу P4 (Сл. 5j). Сепак, во IPR клетките околу P5, разликата во ориентацијата на рамнината на клеточната делба стана статистички значајна, со нагло зголемување на фреквенцијата на попречните клеточни поделби (Сл. 5j). Заедно, овие резултати сугерираат дека GA сигнализацијата може да ја контролира ориентацијата на клеточните поделби во SAM, што е во согласност со претходните извештаи40,41 дека високата GA сигнализација може да предизвика латерална ориентација на клеточните поделби во IPR.
Се предвидува дека клетките во IPR нема да бидат инкорпорирани во примордија, туку во интерноди2,42,43. Попречната ориентација на клеточните поделби во IPR може да резултира со типична организација на паралелни надолжни редови на епидермални клетки во интернодилите. Нашите набљудувања опишани погоре сугерираат дека GA сигнализацијата веројатно игра улога во овој процес со регулирање на насоката на клеточната делба.
Губењето на функцијата на неколку DELLA гени резултира со конститутивен GA одговор, а мутантите на della можат да се користат за тестирање на оваа хипотеза44. Прво ги анализиравме шемите на експресија на пет DELLA гени во SAM. Транскрипциската фузија на линијата GUS45 откри дека GAI, RGA, RGL1 и RGL2 (во многу помала мера) се експресирани во SAM (Дополнителна слика 11a-d). In situ хибридизацијата дополнително покажа дека GAI mRNA се акумулира специфично во примордија и цветови во развој (Дополнителна слика 11e). RGL1 и RGL3 mRNA беа откриени низ целата крошна на SAM и кај постари цветови, додека RGL2 mRNA беше позастапена во граничниот регион (Дополнителна слика 11f-h). Конфокалното снимање на pRGL3::RGL3-GFP SAM ја потврди експресијата забележана со in situ хибридизација и покажа дека протеинот RGL3 се акумулира во централниот дел на SAM (Дополнителна слика 11i). Користејќи ја линијата pRGA::GFP-RGA, откривме и дека протеинот RGA се акумулира во SAM, но неговото изобилство се намалува на границата почнувајќи од P4 (Дополнителна слика 11j). Имено, моделите на експресија на RGL3 и RGA се во согласност со повисоката активност на GA сигнализација во IPR, како што е откриено со qmRGA (Слика 4). Покрај тоа, овие податоци укажуваат дека сите DELLA се експресирани во SAM и дека нивната експресија колективно го опфаќа целиот SAM.
Потоа ги анализиравме параметрите на клеточната делба кај SAM од див тип (Ler, контрола) и gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) мутантите (Сл. 6a, b). Интересно е што забележавме статистички значајно поместување во распределбата на фреквенциите на аголот на клеточната делба кај SAM со мутант della global во споредба со дивиот тип (Сл. 6c). Оваа промена кај мутантот della global се должеше на зголемување на фреквенцијата на аглите од 80-90° (34,71% наспроти 24,55%) и, во помала мера, на аглите од 70-80° (23,78% наспроти 20,18%), т.е. што одговара на трансверзалните клеточни поделби (Сл. 6c). Фреквенцијата на нетрансверзални поделби (0-60°) беше исто така помала кај мутантот della global (Сл. 6c). Фреквенцијата на трансверзални клеточни поделби беше значително зголемена во SAM на мутантот della global (Сл. 6б). Фреквенцијата на трансверзални клеточни поделби во IPR беше исто така поголема кај мутантот della global во споредба со дивиот тип (Сл. 6д). Надвор од регионот IPR, дивиот тип имаше порамномерна распределба на аглите на клеточната делба, додека мутантот della global претпочиташе тангенцијални поделби како IPR (Сл. 6е). Исто така, ја квантифициравме ориентацијата на клеточните поделби во SAM на мутанти од квинтрупна ga2 оксидаза (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 и ga2ox6-2), позадина на неактивен мутант на GA во која се акумулира GA. Во согласност со зголемувањето на нивоата на GA, SAM на петкратната инфлоресценција на мутантот ga2ox беше поголема од онаа на Col-0 (Дополнителна слика 12a, b), и во споредба со Col-0, петкратната ga2ox SAM покажа значително различна распределба на аглите на клеточната делба, при што фреквенцијата на аголот се зголемува од 50° до 90°, т.е. повторно фаворизирајќи тангенцијални поделби (Дополнителна слика 12a–c). Така, покажуваме дека конститутивната активација на GA сигнализацијата и акумулацијата на GA индуцираат латерални клеточни поделби во IPR и остатокот од SAM.
a, b 3D визуелизација на L1 слојот од PI-боен Ler (a) и глобален della мутант (b) SAM со употреба на конфокална микроскопија. Новите клеточни ѕидови формирани во SAM (но не и примордиумот) во период од 10 часа се прикажани и обоени според нивните вредности на аголот. Вметнатиот дел го прикажува SAM на 0 часа. Лентата со бои е прикажана во долниот десен агол. Стрелката во (b) покажува кон пример на порамнети датотеки на клетки во глобалниот della мутант. Експериментот беше повторен двапати со слични резултати. ce споредба на фреквентната распределба на ориентациите на рамнината на клеточната делба во целиот SAM (d), IPR (e) и не-IPR (f) помеѓу Ler и глобален della. P вредностите се добиени со употреба на двостран Колмогоров-Смирнов тест. f, g 3D визуелизација на конфокални слики од PI-боен SAM на Col-0 (i) и pCUC2::gai-1-VENUS (j) трансгени растенија. Панелите (a, b) покажуваат нови клеточни ѕидови (но не и примордија) формирани во SAM во рок од 10 часа. Експериментот беше повторен двапати со слични резултати. h–j Споредба на фреквентната распределба на ориентациите на рамнината на клеточната делба лоцирани во целиот SAM (h), IPR (i) и не-IPR (j) помеѓу растенијата Col-0 и pCUC2::gai-1-VENUS. P вредностите се добиени со помош на двостран Колмогоров-Смирнов тест.
Потоа го тестиравме ефектот на инхибирање на GA сигнализацијата специфично во IPR. За таа цел, го користевме промотерот на котиледонската чаша 2 (CUC2) за да ја поттикнеме експресијата на доминантен негативен gai-1 протеин споен со VENUS (во линијата pCUC2::gai-1-VENUS). Во SAM од див тип, промотерот CUC2 ја поттикнува експресијата на повеќето IPR во SAM, вклучувајќи ги и граничните клетки, од P4 па натаму, а слична специфична експресија беше забележана кај растенијата pCUC2::gai-1-VENUS (видете подолу). Распределбата на аглите на клеточната делба низ SAM или IPR на растенијата pCUC2::gai-1-VENUS не беше значително различна од онаа на дивиот тип, иако неочекувано откривме дека клетките без IPR во овие растенија се делат со поголема фреквенција од 80-90° (Сл. 6f-j).
Се претпоставува дека насоката на клеточната делба зависи од геометријата на SAM, особено од затегнувачкиот стрес генериран од закривеноста на ткивото46. Затоа прашавме дали обликот на SAM е променет кај растенијата della global мутанти и pCUC2::gai-1-VENUS. Како што беше претходно објавено12, големината на della global мутантите SAM беше поголема од онаа на дивиот тип (Дополнителна слика 13a, b, d). In situ хибридизацијата на CLV3 и STM RNA ја потврди експанзијата на меристем кај della мутантите и дополнително покажа латерална експанзија на нишата на матичните клетки (Дополнителна слика 13e, f, h, i). Сепак, закривеноста на SAM беше слична кај двата генотипови (Дополнителна слика 13k, m, n, p). Забележавме слично зголемување на големината кај четвороделниот мутант gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della без промена во закривеноста во споредба со дивиот тип (Дополнителна слика 13c, d, g, j, l, o, p). Фреквенцијата на ориентацијата на клеточната делба беше исто така засегната кај четвороделниот мутант della, но во помала мера отколку кај монолитниот мутант della (Дополнителна слика 12d–f). Овој ефект на дозирање, заедно со недостатокот на ефект врз закривеноста, сугерира дека преостанатата активност на RGL3 кај четвороделниот мутант Della ги ограничува промените во ориентацијата на клеточната делба предизвикани од губење на активноста на DELLA и дека промените во латералните клеточни поделби се јавуваат како одговор на промените во активноста на GA сигнализација, а не на промените во геометријата на SAM. Како што е опишано погоре, промотерот CUC2 ја движи IPR експресијата во SAM почнувајќи од P4 (Дополнителна слика 14a, b), а за разлика од тоа, pCUC2::gai-1-VENUS SAM имаше намалена големина, но поголема закривеност (Дополнителна слика 14c–h). Оваа промена во морфологијата на pCUC2::gai-1-VENUS SAM може да резултира со различна распределба на механичките стресови во споредба со дивиот тип, кај кој високите периферни стресови започнуваат на пократко растојание од центарот на SAM47. Алтернативно, промените во морфологијата на pCUC2::gai-1-VENUS SAM може да бидат резултат на промени во регионалните механички својства предизвикани од трансгенската експресија48. Во двата случаи, ова би можело делумно да ги компензира ефектите од промените во GA сигнализацијата со зголемување на веројатноста клетките да се поделат во периферна/попречна ориентација, објаснувајќи ги нашите набљудувања.
Земени заедно, нашите податоци потврдуваат дека повисоката GA сигнализација игра активна улога во латералната ориентација на рамнината на клеточната делба во IPR. Тие исто така покажуваат дека закривеноста на меристемот, исто така, влијае на ориентацијата на рамнината на клеточната делба во IPR.
Попречната ориентација на рамнината на поделбата во IPR, поради високата активност на GA сигнализација, сугерира дека GA претходно организира радијална датотека на клетки во епидермисот во рамките на SAM за да ја дефинира клеточната организација што подоцна ќе се најде во епидермалниот интернод. Всушност, ваквите датотеки на клетките беа често видливи на SAM сликите на della global мутантите (Сл. 6б). Така, за понатамошно истражување на развојната функција на просторниот модел на GA сигнализацијата во SAM, користевме снимање со временски застој за да ја анализираме просторната организација на клетките во IPR кај див тип (Ler и Col-0), della global мутантите и трансгените растенија pCUC2::gai-1-VENUS.
Откривме дека qmRGA покажа дека активноста на GA сигнализација во IPR се зголемила од P1/P2 и достигнала врв на P4, а овој модел останал константен со текот на времето (Сл. 4a–f и Дополнителна слика 8c–f, k). За да ја анализираме просторната организација на клетките во IPR со зголемување на GA сигналот, ги обележавме Ler IPR клетките над и од страните на P4 според нивната развојна судбина анализирана 34 часа по првото набљудување, т.е. повеќе од два пластидни пати, што ни овозможи да ги следиме IPR клетките за време на развојот на примордиумот од P1/P2 до P4. Користевме три различни бои: жолта за оние клетки кои беа интегрирани во примордиумот во близина на P4, зелена за оние кои беа во IPR и виолетова за оние кои учествуваа во двата процеса (Сл. 7a–c). На t0 (0 h), 1–2 слоја на IPR клетки беа видливи пред P4 (Сл. 7a). Како што се очекуваше, кога овие клетки се делеа, тоа го правеа главно преку попречната рамнина на делба (сл. 7a–c). Слични резултати се добиени со користење на Col-0 SAM (фокусирајќи се на P3, чија граница се преклопува слично на P4 во Ler), иако во овој генотип, преклопот формиран на цветната граница ги криеше IPR клетките побрзо (сл. 7g–i). Така, моделот на делба на IPR клетките ги претходно организира клетките во радијални редови, како во интернодите. Организацијата на радијалните редови и локализацијата на IPR клетките помеѓу последователните органи сугерираат дека овие клетки се интернодални предци.
Тука, развивме ратиометриски GA сигнален биосензор, qmRGA, кој овозможува квантитативно мапирање на GA сигналната активност што произлегува од комбинираните концентрации на GA и GA рецепторите, додека се минимизира пречките со ендогените сигнални патишта, со што се обезбедуваат информации за функцијата на GA на клеточно ниво. За таа цел, конструиравме модифициран DELLA протеин, mRGA, кој ја изгубил способноста да се врзува за партнерите за интеракција на DELLA, но останува чувствителен на GA-индуцирана протеолиза. qmRGA реагира и на егзогени и на ендогени промени во нивоата на GA, а неговите динамички сензорски својства овозможуваат проценка на просторно-временските промени во GA сигналната активност за време на развојот. qmRGA е исто така многу флексибилна алатка бидејќи може да се прилагоди на различни ткива со промена на промотерот што се користи за негова експресија (доколку е потребно), а со оглед на конзервираната природа на GA сигналниот пат и мотивот PFYRE кај скриносемениците, веројатно е дека ќе може да се пренесе на други видови22. Во согласност со ова, еквивалентна мутација во протеинот SLR1 DELLA од ориз (HYY497AAA) исто така покажа дека ја потиснува активноста на репресорот за раст на SLR1, додека само малку ја намалува неговата GA-посредувана деградација, слично на mRGA23. Имено, неодамнешните студии кај Arabidopsis покажаа дека мутација на една аминокиселина во доменот PFYRE (S474L) ја измени транскрипциската активност на RGA без да влијае на нејзината способност да комуницира со партнерите на транскрипцискиот фактор50. Иако оваа мутација е многу блиску до 3-те аминокиселински супституции присутни во mRGA, нашите студии покажуваат дека овие две мутации ги менуваат различните карактеристики на DELLA. Иако повеќето партнери на транскрипцискиот фактор се врзуваат за домените LHR1 и SAW на DELLA26,51, некои конзервирани аминокиселини во доменот PFYRE можат да помогнат во стабилизирањето на овие интеракции.
Развојот на интернодите е клучна карактеристика во архитектурата на растенијата и подобрувањето на приносот. qmRGA откри повисока активност на GA сигнализација во IPR интернодните прогениторни клетки. Со комбинирање на квантитативно снимање и генетика, покажавме дека GA сигналните шеми ги надвиснуваат кружните/попречните рамнини на клеточната делба во епидермисот на SAM, обликувајќи ја организацијата на клеточната делба потребна за развој на интернодот. Неколку регулатори на ориентацијата на рамнината на клеточната делба се идентификувани за време на развојот52,53. Нашата работа дава јасен пример за тоа како активноста на GA сигнализација го регулира овој клеточен параметар. DELLA може да комуницира со претходно преклопувачки протеински комплекси41, така што GA сигнализацијата може да ја регулира ориентацијата на рамнината на клеточната делба со директно влијание врз ориентацијата на кортикалните микротубули40,41,54,55. Неочекувано покажавме дека кај SAM, корелатот на повисоката активност на GA сигнализација не беше издолжување или делба на клетките, туку само анизотропија на растот, што е во согласност со директниот ефект на GA врз насоката на клеточната делба во IPR. Сепак, не можеме да исклучиме дека овој ефект може да биде и индиректен, на пример посредуван од омекнување на клеточниот ѕид предизвикан од GA56. Промените во својствата на клеточниот ѕид предизвикуваат механички стрес57,58, кој исто така може да влијае на ориентацијата на рамнината на клеточната делба со тоа што влијае на ориентацијата на кортикалните микротубули39,46,59. Комбинираните ефекти на механичкиот стрес предизвикан од GA и директната регулација на ориентацијата на микротубулите од страна на GA може да бидат вклучени во генерирање на специфичен модел на ориентација на клеточната делба во IPR за да се дефинираат интернодите, и потребни се понатамошни студии за да се тестира оваа идеја. Слично на тоа, претходните студии ја истакнаа важноста на протеините TCP14 и 15 кои интерактивно дејствуваат со DELLA во контролата на формирањето на интернодите60,61 и овие фактори може да посредуваат во дејството на GA заедно со BREVIPEDICELLUS (BP) и PENNYWISE (PNY), кои го регулираат развојот на интернодите и за кои е покажано дека влијаат на GA сигнализацијата2,62. Со оглед на тоа што DELLA реагираат со сигналните патишта на брасиностероид, етилен, јасмонска киселина и апсцисинска киселина (ABA)63,64 и дека овие хормони можат да влијаат на ориентацијата на микротубулите65, ефектите на GA врз ориентацијата на клеточната делба може да бидат посредувани и од други хормони.
Раните цитолошки студии покажаа дека и внатрешниот и надворешниот регион на Arabidopsis SAM се потребни за развој на интернодулите2,42. Фактот дека GA активно ја регулира клеточната делба во внатрешните ткива12 ја поддржува двојната функција на GA во регулирањето на меристемот и големината на интернодулите во SAM. Моделот на насочена клеточна делба е исто така цврсто регулиран во внатрешното ткиво на SAM, а оваа регулација е од суштинско значење за растот на стеблото52. Ќе биде интересно да се испита дали GA игра улога и во ориентирањето на рамнината на клеточната делба во внатрешната организација на SAM, со што се синхронизира спецификацијата и развојот на интернодите во рамките на SAM.
Растенијата беа одгледувани in vitro во почва или 1x Murashige-Skoog (MS) медиум (Duchefa) дополнет со 1% сахароза и 1% агар (Sigma) под стандардни услови (16 часа светлина, 22 °C), освен за експерименти со хипокотил и раст на коренот во кои садниците беа одгледувани на вертикални плочи под константна светлина и 22 °C. За експерименти со нитрати, растенијата беа одгледувани на модифициран MS медиум (bioWORLD растителен медиум) дополнет со соодветен нитрат (0 или 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-сукцинат, 1% сахароза и 1% А-агар (Sigma) под услови на долг ден.
GID1a cDNA вметната во pDONR221 беше рекомбинирана со pDONR P4-P1R-pUBQ10 и pDONR P2R-P3-mCherry во pB7m34GW за да се генерира pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 ДНК вметната во pDONR221 беше рекомбинирана во pB7RWG266 за да се генерира p35S:IDD2-RFP. За да се генерира pGID1b::2xmTQ2-GID1b, фрагмент од 3,9 kb пред кодирачкиот регион на GID1b и фрагмент од 4,7 kb што ја содржи кДНК на GID1b (1,3 kb) и терминатор (3,4 kb) прво беа амплифицирани со помош на прајмерите во Дополнителната табела 3, а потоа беа вметнати во pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) и pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), соодветно, и конечно рекомбинирани со pDONR221 2xmTQ268 во целниот вектор pGreen 012567 со помош на клонирање Gateway. За да се генерира pCUC2::LSSmOrange, промоторската секвенца на CUC2 (3229 bp низводно од ATG) проследена со кодирачката секвенца на големиот Стоукс-поместен mOrange (LSSmOrange)69 со N7 сигналот за нуклеарна локализација и транскрипцискиот терминатор на NOS беа собрани во векторот за таргетирање на канамицин pGreen користејќи го системот за рекомбинација на 3-фрагменти Gateway (Invitrogen). Бинарниот вектор на растението беше воведен во сојот GV3101 на Agrobacterium tumefaciens и воведен во листовите на Nicotiana benthamiana со методот на инфилтрација на Agrobacterium и во Arabidopsis thaliana Col-0 со методот на цветно натопување, соодветно. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry и pCLV3::mCherry-NLS qmRGA беа изолирани од потомците F3 и F1 на соодветните вкрстувања, соодветно.
Хибридизацијата на РНК in situ беше извршена на врвови од изданоци долги приближно 1 cm72, кои беа собрани и веднаш фиксирани во раствор на FAA (3,7% формалдехид, 5% оцетна киселина, 50% етанол) претходно изладен на 4 °C. По 2 × 15 минути вакуумски третмани, фиксативот беше променет и примероците беа инкубирани преку ноќ. CDNA на GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 и RGL3 и антисенс сонди на нивните 3′-UTR беа синтетизирани со помош на прајмерите прикажани во Дополнителната табела 3 како што е опишано од Rosier et al.73. Сонди обележани со дигоксигенин беа имунодетектирани со употреба на антитела на дигоксигенин (3000-кратно разредување; Roche, каталошки број: 11 093 274 910), а деловите беа обоени со раствор од 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP, 250-кратно разредување)/нитроблу тетразолиум (NBT, 200-кратно разредување).
Време на објавување: 10 февруари 2025 година