Во оваа студија, стимулативните ефекти од комбинираниот третман нарегулатори на раст на растенијата(2,4-D и кинетин) и наночестички од железен оксид (Fe₃O₄-NPs) врз in vitro морфогенезата и производството на секундарни метаболити во *Hypericum perforatum* L. беа испитани. Оптимизираниот третман [2,4-D (0,5 mg/L) + кинетин (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] значително ги подобри параметрите за раст на растението: висината на растението се зголеми за 59,6%, должината на коренот за 114,0%, бројот на пупки за 180,0% и свежата тежина на калусот за 198,3% во споредба со контролната група. Овој комбиниран третман, исто така, ја подобри ефикасноста на регенерација (50,85%) и ја зголеми содржината на хиперицин за 66,6%. GC-MS анализата покажа висока содржина на хиперозид, β-патолен и цетил алкохол, што претставува 93,36% од вкупната површина на пикот, додека содржината на вкупните феноли и флавоноиди се зголеми за дури 80,1%. Овие резултати укажуваат дека регулаторите на раст на растенијата (PGR) и наночестичките Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) имаат синергистички ефект преку стимулирање на органогенезата и акумулацијата на биоактивни соединенија, што претставува ветувачка стратегија за биотехнолошко подобрување на лековитите растенија.
Кантарионот (Hypericum perforatum L.), исто така познат како кантарион, е повеќегодишно тревесто растение од семејството Hypericaceae кое има економска вредност.[1] Неговите потенцијални биоактивни компоненти вклучуваат природни танини, ксантони, флороглуцинол, нафталендиантрон (хиперин и псевдохиперин), флавоноиди, фенолни киселини и есенцијални масла.[2,3,4] Кантарионот може да се размножува со традиционални методи; сепак, сезонската природа на традиционалните методи, ниското ртење на семето и подложноста на болести го ограничуваат неговиот потенцијал за одгледување на големи размери и континуирано формирање на секундарни метаболити.[1,5,6]
Според тоа, културата на ткиво in vitro се смета за ефикасен метод за брзо размножување на растенијата, зачувување на ресурсите на герминативната плазма и зголемен принос на лековити соединенија [7, 8]. Регулаторите на раст на растенијата (PGR) играат клучна улога во регулирањето на морфогенезата и се неопходни за in vitro одгледување на калус и цели организми. Оптимизацијата на нивните концентрации и комбинации е клучна за успешно завршување на овие развојни процеси [9]. Затоа, разбирањето на соодветниот состав и концентрација на регулаторите е важно за подобрување на растот и регенеративната способност на кантарионот (H. perforatum) [10].
Наночестичките од железен оксид (Fe₃O₄) се класа на наночестички кои се развиваат или се развиваат за ткивна култура. Fe₃O₄ има значајни магнетни својства, добра биокомпатибилност и способност да го поттикне растот на растенијата и да го намали стресот од околината, па затоа привлече значително внимание во дизајните на ткивни култури. Потенцијалните примени на овие наночестички може да вклучуваат оптимизирање на in vitro културата за да се поттикне клеточната делба, да се подобри апсорпцијата на хранливи материи и да се активираат антиоксидантни ензими [11].
Иако наночестичките покажаа добри промотивни ефекти врз растот на растенијата, студиите за комбинирана примена на наночестички Fe₃O₄ и оптимизирани регулатори за раст на растенијата кај *H. perforatum* остануваат оскудни. За да се пополни оваа празнина во знаењето, оваа студија ги оцени ефектите од нивните комбинирани ефекти врз морфогенезата и производството на секундарни метаболити in vitro за да обезбеди нови сознанија за подобрување на карактеристиките на лековитите растенија. Затоа, оваа студија има две цели: (1) оптимизирање на концентрацијата на регулатори за раст на растенијата за ефикасно да се поттикне формирањето на калус, регенерацијата на изданоците и вкоренувањето in vitro; и (2) евалуација на ефектите на наночестичките Fe₃O₄ врз параметрите на раст in vitro. Идните планови вклучуваат евалуација на стапката на преживување на регенерираните растенија за време на аклиматизацијата (in vitro). Се очекува дека резултатите од оваа студија значително ќе ја подобрат ефикасноста на микроразмножување на *H. perforatum*, со што ќе придонесат за одржлива употреба и биотехнолошки примени на ова важно лековито растение.
Во оваа студија, добивме експлантати од листови од едногодишни растенија од кантарион (мајчини растенија) одгледувани на терен. Овие експлантати беа користени за оптимизирање на условите за in vitro култура. Пред култивирањето, листовите беа темелно исплакнати под млаз дестилирана вода неколку минути. Површините на експлантатите потоа беа дезинфицирани со потопување во 70% етанол 30 секунди, по што следеше потопување во 1,5% раствор од натриум хипохлорит (NaOCl) што содржи неколку капки Tween 20 10 минути. Конечно, експлантатите беа исплакнати три пати со стерилна дестилирана вода пред да се префрлат во следниот медиум за култура.
Во текот на следните четири недели, беа мерени параметрите за регенерација на изданоците, вклучувајќи ја стапката на регенерација, бројот на изданоци по експлант и должината на изданоците. Кога регенерираните изданоци достигнаа должина од најмалку 2 cm, тие беа префрлени во медиум за вкоренување кој се состоеше од медиум со половина јачина на MS, 0,5 mg/L индолбутерна киселина (IBA) и 0,3% гуар гума. Културата за вкоренување продолжи три недели, за кое време беа мерени стапката на вкоренување, бројот на корени и должината на коренот. Секој третман беше повторен три пати, со култивирани 10 експлантати по повторување, давајќи приближно 30 експлантати по третман.
Висината на растението беше мерена во сантиметри (cm) со помош на линијар, од основата на растението до врвот на највисокиот лист. Должината на коренот беше мерена во милиметри (mm) веднаш по внимателното отстранување на садниците и отстранувањето на подлогата за растење. Бројот на пупки по експлант беше изброен директно на секое растение. Бројот на црни точки на листовите, познати како нодули, беше мерен визуелно. Се верува дека овие црни нодули се жлезди што содржат хиперицин, или оксидативни точки, и се користат како физиолошки индикатор за одговорот на растението на третманот. По отстранувањето на целата подлога за растење, свежата тежина на садниците беше мерена со помош на електронска вага со точност од милиграми (mg).
Методот за пресметување на брзината на формирање на калус е следниот: по култивирање на експлантати во медиум што содржи различни регулатори на раст (кинази, 2,4-D и Fe3O4) во тек на четири недели, се брои бројот на експлантати способни за формирање на калус. Формулата за пресметување на брзината на формирање на калус е следната:
Секој третман беше повторен три пати, при што беа испитани најмалку 10 експлантати во секое повторување.
Стапката на регенерација го одразува процентот на ткивото на калусот кое успешно го завршува процесот на диференцијација на пупките по фазата на формирање на калусот. Овој индикатор ја покажува способноста на ткивото на калусот да се трансформира во диференцирано ткиво и да прерасне во нови растителни органи.
Коефициентот на вкоренување е односот на бројот на гранки способни за вкоренување кон вкупниот број на гранки. Овој индикатор го одразува успехот на фазата на вкоренување, што е клучно во микроразмножувањето и размножувањето на растенијата, бидејќи доброто вкоренување им помага на садниците подобро да преживеат во услови на раст.
Хиперицинските соединенија беа екстрахирани со 90% метанол. Педесет мг сушен растителен материјал беше додаден во 1 мл метанол и соникиран 20 минути на 30 kHz во ултразвучен чистач (модел A5120-3YJ) на собна температура во темница. По соникирањето, примерокот беше центрифугиран на 6000 вртежи во минута 15 минути. Супернатантот беше собран, а апсорпцијата на хиперицинот беше измерена на 592 nm со помош на Plus-3000 S спектрофотометар според методот опишан од Консеисао и сор. [14].
Повеќето третмани со регулатори на раст на растенијата (PGR) и наночестички од железен оксид (Fe₃O₄-NPs) не предизвикаа формирање на црни нодули на регенерираните листови од изданок. Не беа забележани нодули во ниту еден од третманите со 0,5 или 1 mg/L 2,4-D, 0,5 или 1 mg/L кинетин, или 1, 2 или 4 mg/L наночестички од железен оксид. Неколку комбинации покажаа мало зголемување на развојот на нодули (но не статистички значајно) при повисоки концентрации на кинетин и/или наночестички од железен оксид, како што е комбинацијата на 2,4-D (0,5–2 mg/L) со кинетин (1–1,5 mg/L) и наночестички од железен оксид (2–4 mg/L). Овие резултати се прикажани на Слика 2. Црните нодули претставуваат жлезди богати со хиперицин, кои се јавуваат природно и се корисни. Во оваа студија, црните нодули беа главно поврзани со кафеаво пожолтување на ткивата, што укажува на поволна средина за акумулација на хиперицин. Третманот со 2,4-D, кинетин и наночестички Fe₃O₄ го поттикна растот на калусот, го намали потемнувањето и ја зголеми содржината на хлорофил, што укажува на подобрена метаболичка функција и потенцијално намалување на оксидативното оштетување [37]. Оваа студија ги оцени ефектите на кинетинот во комбинација со 2,4-D и Fe₃O₄ наночестички врз растот и развојот на калус од кантарион (Сл. 3a–g). Претходните студии покажаа дека наночестичките Fe₃O₄ имаат антифунгални и антимикробни активности [38, 39] и, кога се користат во комбинација со регулатори на раст на растенијата, можат да ги стимулираат механизмите за одбрана на растенијата и да ги намалат индексите на клеточен стрес [18]. Иако биосинтезата на секундарните метаболити е генетски регулирана, нивниот вистински принос е многу зависен од условите на животната средина. Метаболните и морфолошките промени можат да влијаат на нивоата на секундарните метаболити со регулирање на експресијата на специфични растителни гени и реагирање на фактори на животната средина. Понатаму, индуктори можат да предизвикаат активирање на нови гени, што пак ја стимулира ензимската активност, на крајот активирајќи повеќе биосинтетски патишта и доведувајќи до формирање на секундарни метаболити. Понатаму, друга студија покажа дека намалувањето на сенчењето ја зголемува изложеноста на сончева светлина, со што се зголемуваат дневните температури во природното живеалиште на *Hypericum perforatum*, што исто така придонесува за зголемен принос на хиперицин. Врз основа на овие податоци, оваа студија ја испита улогата на железните наночестички како потенцијални индуктори во ткивната култура. Резултатите покажаа дека овие наночестички можат да активираат гени вклучени во биосинтезата на хесперидин преку ензимска стимулација, што доведува до зголемена акумулација на ова соединение (сл. 2). Затоа, во споредба со растенијата што растат во природни услови, може да се тврди дека производството на такви соединенија in vivo може да се зголеми и кога умерениот стрес се комбинира со активирање на гените вклучени во биосинтезата на секундарните метаболити. Комбинираните третмани генерално имаат позитивен ефект врз стапката на регенерација, но во некои случаи, овој ефект е ослабен. Имено, третманот со 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L киназа и различни концентрации може независно и значително да ја зголеми стапката на регенерација за 50,85% во споредба со контролната група (сл. 4c). Овие резултати укажуваат дека специфичните комбинации на нанохормони можат да дејствуваат синергистички за да го поттикнат растот на растенијата и производството на метаболити, што е од големо значење за ткивната култура на лековити растенија. Палмер и Келер [50] покажаа дека третманот со 2,4-D може независно да предизвика формирање на калус кај St. perforatum, додека додавањето на киназа значително го зголеми формирањето и регенерацијата на калус. Овој ефект се должи на подобрувањето на хормоналната рамнотежа и стимулацијата на клеточната делба. Bal et al. [51] откриле дека третманот со Fe₃O₄-NP може независно да ја подобри функцијата на антиоксидантните ензими, со што се поттикнува растот на коренот кај St. perforatum. Медиумите за култура што содржат Fe₃O₄ наночестички во концентрации од 0,5 mg/L, 1 mg/L и 1,5 mg/L ја подобрија стапката на регенерација на ленените растенија [52]. Употребата на кинетин, 2,4-дихлоробензотиазолинон и наночестички Fe₃O₄ значително ги подобри стапките на формирање на калус и корен, но треба да се земат предвид потенцијалните несакани ефекти од употребата на овие хормони за ин витро регенерација. На пример, долготрајната или висока концентрација на употреба на 2,4-дихлоробензотиазолинон или кинетин може да резултира со соматска клонална варијација, оксидативен стрес, абнормална морфологија на калус или витрификација. Затоа, високата стапка на регенерација не мора нужно да ја предвиди генетската стабилност. Сите регенерирани растенија треба да се проценат со употреба на молекуларни маркери (на пр. RAPD, ISSR, AFLP) или цитогенетска анализа за да се утврди нивната хомогеност и сличност со ин виво растенијата [53,54,55].
Оваа студија за прв пат покажа дека комбинираната употреба на регулатори за раст на растенијата (2,4-D и кинетин) со наночестички Fe₃O₄ може да ја подобри морфогенезата и акумулацијата на клучни биоактивни метаболити (вклучувајќи хиперицин и хиперозид) кај *Hypericum perforatum*. Оптимизираниот режим на третман (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L кинетин + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) не само што го максимизираше формирањето на калус, органогенезата и приносот на секундарни метаболити, туку покажа и благ индуцирачки ефект, потенцијално подобрувајќи ја толеранцијата на стрес и медицинската вредност на растението. Комбинацијата на нанотехнологија и култура на растителни ткива обезбедува одржлива и ефикасна платформа за производство на лековити соединенија во големи размери in vitro. Овие резултати го отвораат патот за индустриски апликации и идни истражувања за молекуларни механизми, оптимизација на дозирањето и генетска прецизност, со што се поврзуваат фундаменталните истражувања за лековити растенија со практичната биотехнологија.
Време на објавување: 12 декември 2025 година