Антихелминтскиот лек N,N-диетил-m-толуамид (DEET) е пријавено дека го инхибира AChE (ацетилхолинестераза) и има потенцијални канцерогени својства поради прекумерна васкуларизација. Во овој труд, покажуваме дека DEET специфично ги стимулира ендотелните клетки кои промовираат ангиогенеза, а со тоа го зголемува растот на туморот. DEET ги активира клеточните процеси кои водат до ангиогенеза, вклучувајќи пролиферација, миграција и адхезија. Ова е поврзано со зголемено производство на NO и VEGF експресија во ендотелијалните клетки. Замолчувањето на М3 или користењето фармаколошки М3 инхибитори ги укина сите овие ефекти, што сугерира дека ангиогенезата индуцирана од DEET е чувствителна на М3. Експериментите кои вклучуваат сигнализирање на калциум во ендотелијалните и HEK-клетките кои прекумерно ги изразуваат М3 рецепторите, како и студиите за врзување и приклучување, покажуваат дека DEET делува како алостеричен модулатор на М3 рецепторите. Понатаму, DEET го инхибира AChE, а со тоа ја зголемува биорасположивоста на ацетилхолин и неговото врзување за М3 рецепторите и ги подобрува проангиогените ефекти преку алостерична регулација.
Примарните ЕК беа изолирани од аортата на швајцарските глувци. Методот на екстракција беше адаптиран од протоколот Кобајаши 26 . ЕК од глувци беа култивирани во медиум EBM-2 дополнет со 5% инактивиран со топлина FBS до четвртиот премин.
Ефектот на две концентрации на DEET врз пролиферацијата на HUVEC, U87MG или BF16F10 беше анализиран со користење на комплетот за анализа за пролиферација на клетките CyQUANT (Молекуларни сонди, C7026). Накратко, 5,103 клетки по бунар беа засеани во плоча со 96 бунари, беше дозволено да се закачат преку ноќ, а потоа беа третирани со DEET 24 часа. По отстранувањето на медиумот за раст, додајте раствор за врзување на бојата во секој бунар од микроплочката и инкубирајте ги клетките на 37 °C 30 мин. Нивоата на флуоресценција беа одредени со помош на мултимоден читач на микроплочи Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германија) опремен со филтри за возбудување од 485 nm и филтри за емисија од 530 nm.
HUVEC беа засеани во плочи со 96 бунари со густина од 104 клетки по бунар. Клетките беа третирани со DEET 24 часа. Одржливоста на клетките беше проценета со користење на колориметриска MTT анализа (Sigma-Aldrich, M5655). Вредностите на оптичката густина се добиени на мултимоден читач на микроплочи (Mithras LB940) на бранова должина од 570 nm.
Ефектите на DEET беа проучувани со користење на ин витро анализи на ангиогенезата. Третманот со 10-8 M или 10-5 M DEET го зголеми формирањето на капиларна должина кај HUVECs (сл. 1a, b, бели шипки). Во споредба со контролната група, третманот со концентрации на DEET кои се движат од 10-14 до 10-5 M покажа дека должината на капиларите достигна плато на 10-8 M DEET (Дополнителна слика S2). Не беше пронајдена значајна разлика во ин витро проангиогениот ефект на HUVECs третирани со DEET во опсегот на концентрации од 10-8 M и 10-5 M.
За да го одредиме ефектот на DEET врз неоваскуларизацијата, извршивме ин виво студии за неоваскуларизација. По 14 дена, глувците инјектирани со ендотелијални клетки предкултурирани со 10-8 M или 10-5 M DEET покажаа значително зголемување на содржината на хемоглобин (сл. 1c, бели ленти).
Понатаму, неоваскуларизацијата предизвикана од DEET беше проучена кај глувци со ксенографт U87MG кои беа инјектирани дневно (ip) со DEET во доза за која е познато дека индуцира плазматски концентрации од 10-5 M, што е нормално кај изложени луѓе. кај 23. Откривачки тумори (т.е. тумори >100 mm3) беа забележани 14 дена по инјектирањето на U87MG клетки кај глувци. На 28-миот ден, растот на туморот беше значително зголемен кај глувци третирани со DEET во споредба со контролните глувци (сл. 1d, квадрати). Понатаму, CD31 боењето на туморите покажа дека DEET значително ја зголемува капиларната површина, но не и густината на микросадовите. (сл. 1e–g).
За да се одреди улогата на мускаринските рецептори во DETA-индуцираната пролиферација, користена е 10-8 M или 10-5 M DETA во присуство на pFHHSiD (10-7 M, селективен антагонист на М3 рецепторот). Третман на HUVEC. pFHHSiD целосно ги блокираше пролиферативните својства на DETA во сите концентрации (Табела 1).
Под овие услови, испитавме и дали DEET ќе ја зголеми должината на капиларите во HUVEC клетките. Слично на тоа, pFHHSiD значително ја спречи капиларната должина индуцирана од DEET (сл. 1а, б, сиви ленти). Понатаму, слични експерименти беа направени со M3 siRNA. Иако контролната siRNA не беше ефикасна во промовирањето на формирање на капилари, замолчувањето на M3 мускаринскиот рецептор ја укина способноста на DEET да ја зголемува должината на капиларите (сл. 1a, b, црни шипки).
Понатаму, и 10-8 M или 10-5 M DEET-индуцирана васкуларизација in vitro и неоваскуларизација in vivo беа целосно блокирани од pFHHSiD (сл. 1c, d, кругови). Овие резултати покажуваат дека DEET промовира ангиогенеза преку патека чувствителна на селективни антагонисти на рецепторот М3 или М3 siRNA.
AChE е молекуларна цел на DEET. Лековите како што е донепезил, кои делуваат како инхибитори на AChE, можат да ја стимулираат ЕК ангиогенезата ин витро и кај моделите на исхемија на задните екстремитети на глувци14. Го тестиравме ефектот на две концентрации на DEET врз активноста на ензимот AChE во HUVEC. Ниските (10-8 M) и високите (10-5 M) концентрации на DEET ја намалија активноста на ендотелијалната AChE во споредба со контролните услови (сл. 2).
Двете концентрации на DEET (10-8 M и 10-5 M) ја намалија активноста на ацетилхолинестераза на HUVEC. BW284c51 (10-5 M) се користеше како контрола за инхибитори на ацетилхолинестераза. Резултатите се изразени како процент од активноста на AChE на HUVEC третирана со двете концентрации на DEET во споредба со клетките третирани со вехикулум. Вредностите се изразени како средна вредност ± SEM од шест независни експерименти. *p < 0,05 во споредба со контролната (Крускал-Волис и Дан повеќекратен споредбен тест).
Азотниот оксид (NO) е вклучен во ангиогениот процес 33, затоа, беше проучено производството на NO во HUVEC-стимулирани со DEET. Производството на ендотелијално NO третирано со DEET беше зголемено во споредба со контролните клетки, но достигна значење само во доза од 10-8 М (сл. 3в). За да се утврдат молекуларните промени кои го контролираат производството на NO индуцирано од DEET, изразувањето и активирањето на eNOS беа анализирани со вестерн blotting. Иако третманот со DEET не ја промени експресијата на eNOS, тој значително ја зголеми фосфорилацијата на eNOS на неговото активирачко место (Ser-1177) додека го намалува неговото инхибиторно место (Thr-495) во споредба со нетретираните клетки во фосфорилацијата на eNOS (сл. 3d). Понатаму, односот на фосфорилираниот eNOS на местото на активирање и инхибиторното место беше пресметан по нормализирањето на количината на фосфорилираниот eNOS до вкупната количина на ензимот. Овој сооднос беше значително зголемен кај HUVECs третирани со секоја концентрација на DEET во споредба со нетретираните клетки (сл. 3г).
Конечно, изразувањето на VEGF, еден од главните проангиогени фактори, беше анализирано со Western blotting. DEET значително го зголеми VEGF изразот, додека pFHHSiD целосно го блокираше овој израз.
Бидејќи ефектите на DEET се чувствителни и на фармаколошка блокада и на намалување на M3 рецепторите, ја тестиравме хипотезата дека DEET може да го подобри калциумовото сигнализирање. Изненадувачки, DEET не успеа да го зголеми цитоплазматскиот калциум во HUVEC (податоците не се прикажани) и HEK/M3 (сл. 4а, б) за обете употребени концентрации.
Време на објавување: Декември-30-2024 година