Антихелминтскиот лек N,N-диетил-m-толуамид (ДЕЕТ) е објавено дека ја инхибира AChE (ацетилхолинестераза) и има потенцијално канцерогени својства поради прекумерна васкуларизација. Во овој труд, покажуваме дека DEET специфично ги стимулира ендотелните клетки кои ја промовираат ангиогенезата, со што се зголемува растот на туморот. DEET ги активира клеточните процеси што водат до ангиогенеза, вклучувајќи пролиферација, миграција и адхезија. Ова е поврзано со зголемено производство на NO и експресија на VEGF во ендотелните клетки. Замолчувањето на M3 или употребата на фармаколошки M3 инхибитори ги елиминира сите овие ефекти, што сугерира дека ангиогенезата предизвикана од DEET е чувствителна на M3. Експериментите што вклучуваат калциумска сигнализација во ендотелни и HEK клетки кои преекспресираат M3 рецептори, како и студиите за врзување и докирање, укажуваат дека DEET делува како алостеричен модулатор на M3 рецепторите. Понатаму, DEET ја инхибира AChE, со што се зголемува биорасположивоста на ацетилхолинот и неговото врзување за M3 рецепторите, и ги подобрува проангиогените ефекти преку алостерична регулација.
Примарните ЕК беа изолирани од аортата на швајцарски глувци. Методот на екстракција беше адаптиран од протоколот Кобајаши 26. Муринските ЕК беа култивирани во EBM-2 медиум дополнет со 5% термички инактивиран FBS до четвртиот пасаж.
Ефектот на две концентрации на DEET врз пролиферацијата на HUVEC, U87MG или BF16F10 беше анализиран со помош на комплетот за анализа на пролиферација на клетки CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Накратко, 5,103 клетки по бунар беа засеани во плоча со 96 бунари, им беше дозволено да се закачат преку ноќ, а потоа третирани со DEET 24 часа. По отстранувањето на медиумот за раст, додадете раствор за врзување на боја во секоја бунар од микроплочката и инкубирајте ги клетките на 37 °C 30 минути. Нивоата на флуоресценција беа определени со помош на мултимоден читач на микроплочки Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германија) опремен со филтри за побудување од 485 nm и филтри за емисија од 530 nm.
HUVEC беа засеани во плочи со 96 бунари со густина од 104 клетки по бунар. Клетките беа третирани со DEET во тек на 24 часа. Виталноста на клетките беше оценета со помош на колориметриски MTT тест (Sigma-Aldrich, M5655). Вредностите на оптичката густина беа добиени на мултимоден читач на микроплочки (Mithras LB940) на бранова должина од 570 nm.
Ефектите на DEET беа проучени со употреба на ангиогенезиски анализи in vitro. Третманот со 10-8 M или 10-5 M DEET го зголеми формирањето на капиларната должина кај HUVEC (сл. 1a, b, бели ленти). Во споредба со контролната група, третманот со концентрации на DEET кои се движат од 10-14 до 10-5 M покажа дека капиларната должина достигна плато на 10-8 M DEET (Дополнителна слика S2). Не е пронајдена значајна разлика во проангиогениот ефект in vitro на HUVEC третирани со DEET во опсег на концентрација од 10-8 M и 10-5 M.
За да го утврдиме ефектот на DEET врз неоваскуларизацијата, спроведовме in vivo студии за неоваскуларизација. По 14 дена, глувците на кои им беа инјектирани ендотелни клетки претходно култивирани со 10-8 M или 10-5 M DEET покажаа значително зголемување на содржината на хемоглобин (Сл. 1в, бели ленти).
Понатаму, неоваскуларизацијата предизвикана од DEET беше проучена кај глувци со ксенографт U87MG кои беа инјектирани дневно (ip) со DEET во доза за која е познато дека индуцира плазматски концентрации од 10-5 M, што е нормално кај изложени луѓе. кај 23. Откривачки тумори (т.е. тумори >100 mm3) беа забележани 14 дена по инјектирањето на U87MG клетки кај глувци. На 28-миот ден, растот на туморот беше значително зголемен кај глувци третирани со DEET во споредба со контролните глувци (сл. 1d, квадрати). Понатаму, CD31 боењето на туморите покажа дека DEET значително ја зголемува капиларната површина, но не и густината на микросадовите. (сл. 1e–g).
За да се утврди улогата на мускаринските рецептори во пролиферацијата предизвикана од DETA, беше употребен 10-8 M или 10-5 M DETA во присуство на pFHHSiD (10-7 M, селективен антагонист на M3 рецепторот). Третман на HUVEC. pFHHSiD целосно ги блокираше пролиферативните својства на DETA при сите концентрации (Табела 1).
Под овие услови, исто така испитавме дали DEET ќе ја зголеми должината на капиларите во HUVEC клетките. Слично на тоа, pFHHSiD значително ја спречи DEET-индуцираната должина на капиларите (Сл. 1a, b, сиви ленти). Понатаму, слични експерименти беа извршени со M3 siRNA. Иако контролната siRNA не беше ефикасна во промовирањето на формирањето на капиларите, замолчувањето на мускаринскиот рецептор M3 ја поништи способноста на DEET да ја зголеми должината на капиларите (Сл. 1a, b, црни ленти).
Понатаму, и васкуларизацијата индуцирана од 10-8 M или 10-5 M DEET in vitro и неоваскуларизацијата in vivo беа целосно блокирани од pFHHSiD (Сл. 1c, d, кругови). Овие резултати укажуваат дека DEET ја промовира ангиогенезата преку патека чувствителна на селективни антагонисти на M3 рецепторот или M3 siRNA.
AChE е молекуларна цел на DEET. Лекови како донепезил, кои дејствуваат како инхибитори на AChE, можат да ја стимулираат ангиогенезата на ендотелните клетки in vitro и кај модели на исхемија на задните екстремитети кај глувци14. Го тестиравме ефектот на две концентрации на DEET врз активноста на ензимот AChE кај HUVEC. Ниските (10-8 M) и високите (10-5 M) концентрации на DEET ја намалија активноста на ендотелијалната AChE во споредба со контролните услови (сл. 2).
Двете концентрации на DEET (10-8 M и 10-5 M) ја намалија активноста на ацетилхолинестеразата врз HUVEC. BW284c51 (10-5 M) беше користен како контрола за инхибитори на ацетилхолинестераза. Резултатите се изразени како процент на активност на AChE врз HUVEC третирани со двете концентрации на DEET во споредба со клетките третирани со носач. Вредностите се изразени како средна вредност ± SEM од шест независни експерименти. *p < 0,05 во споредба со контролата (Крускал-Волис и Даннов повеќекратен споредбен тест).
Азотниот оксид (NO) е вклучен во ангиогениот процес 33, затоа, беше проучено производството на NO во HUVEC стимулирани од DEET. Производството на ендотелијален NO третиран со DEET беше зголемено во споредба со контролните клетки, но достигна значајност само при доза од 10-8 M (Сл. 3c). За да се утврдат молекуларните промени што го контролираат производството на NO предизвикано од DEET, експресијата и активацијата на eNOS беа анализирани со Western blotting. Иако третманот со DEET не ја промени експресијата на eNOS, тој значително ја зголеми фосфорилацијата на eNOS на неговото место за активирање (Ser-1177), додека го намали неговото инхибиторно место (Thr-495) во споредба со нетретираните клетки во фосфорилацијата на eNOS (Сл. 3d). Понатаму, односот на фосфорилиран eNOS на местото за активирање и инхибиторното место беше пресметан по нормализирање на количината на фосфорилиран eNOS во однос на вкупната количина на ензим. Овој однос беше значително зголемен кај HUVEC третирани со секоја концентрација на DEET во споредба со нетретираните клетки (Сл. 3d).
Конечно, експресијата на VEGF, еден од главните проангиогени фактори, беше анализирана со Western blotting. DEET значително ја зголеми експресијата на VEGF, додека pFHHSiD целосно ја блокираше оваа експресија.
Бидејќи ефектите на DEET се чувствителни и на фармаколошка блокада и на намалување на M3 рецепторите, ја тестиравме хипотезата дека DEET може да го подобри калциумовото сигнализирање. Изненадувачки, DEET не успеа да го зголеми цитоплазматскиот калциум во HUVEC (податоците не се прикажани) и HEK/M3 (сл. 4а, б) за обете употребени концентрации.
Време на објавување: 30 декември 2024 година