Пестицидите играат клучна улога во справувањето со глобалниот недостиг на храна и борбата против болестите што се пренесуваат преку вектори кај луѓето. Сепак, растечкиот проблем со отпорноста на пестициди итно бара откривање на нови соединенија кои ги таргетираат недоволно искористените цели. Каналите на транзиентниот рецепторски потенцијал на инсектите (TRPV) - Nanzhong (Nan) и неактивните (Iav) - можат да формираат хетерологни канали (Nan-Iav) и да се локализираат во механосензорните органи кои посредуваат во геотропизмот, слухот и проприоцепцијата кај инсектите. Некои пестициди, како што е афидопиролидонот (AP), го таргетираат Nan-Iav преку непознати механизми. AP е ефикасен против инсекти што прободуваат и цицаат (хемиптерани), спречувајќи го хранењето со нарушување на функцијата на филаментите. AP може да се врзе само за Nan, но само Nan-Iav може да комуницира со агонисти, вклучувајќи го и ендогениот никотинамид (NAM), со што покажува активност на каналот. И покрај потенцијалот на Nan-Iav како цел на инсектицид, малку се знае за неговото склопување на каналите, местата на регулаторно врзување и регулацијата зависна од Ca2+, што го попречува понатамошниот развој на инсектицидите. Во оваа студија, криоелектронска микроскопија беше употребена за да се утврди структурата на Nan-Iav кај инсектите Hemiptera во состојба без калмодулин-лиганд, како и со AP и NAM на границата на цитоплазматскиот домен на анкиринското повторување (ARD). Изненадувачки, откривме дека самиот протеин Nan може да формира пентамер, кој се стабилизира со AP-посредувани ARD интеракции. Оваа студија открива молекуларни интеракции помеѓу инсектицидите и агонистите и Nan-Iav, истакнувајќи ја важноста на ARD во функцијата и склопувањето на каналот и истражувајќи го механизмот на регулација на Ca2+.
Во контекст на сè посериозните глобални климатски промени, влошувањето на глобалната безбедност на храната е еден од главните предизвици на 21 век, со каскадни последици за општеството.1,2Извештајот на Светската здравствена организација „Состојба на безбедноста на храната и исхраната во светот 2023“ (SOFI) проценува дека приближно 2,33 милијарди луѓе ширум светот страдаат од умерена до тешка несигурност на храната, што е долгогодишен проблем.3,4За жал, се проценува дека годишно се губат 20% до 30% или повеќе од приносите на земјоделските култури поради штетници и патогени, а се очекува глобалното затоплување да ја влоши отпорноста на штетниците и ранливоста на земјоделските култури.4,5,6,7,8Развојот на пестициди е клучен не само за заштита на посевите од штетници и намалување на ширењето на векторски патогени, туку и за борба против векторски преносливи човечки болести како што се денга треската, маларијата и Чагасовата болест, кои се сè поотпорни на пестициди.5,9,10,11
Меѓу главните цели на невротоксичните инсектициди, хетеротетрамерниот TRPV канал Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) претставува класа на инсектицидни цели откриени само во последната деценија, вклучувајќи ги и комерцијално достапните инсектициди како што се имидаклоприд и пираклостробин.12,13,14Полусинтетскиот инсектицид афидопиролифен (AP) е неодамна развиен и комерцијализиран производ чија главна компонента е активниот инсектицид Inscalis®, кој се врзува за AP на субнаномоларно ниво на активност.15AP покажува ниска акутна токсичност кон опрашувачите, корисните инсекти и други нецелни организми, а кога се користи според упатствата на етикетата, може да го намали притисокот на отпорност на други инсектициди.16,17,18Nan и Iav се широко распространети кај инсектите, се коекспресираат само во невроните на рецепторот за истегнување на хордите на антените и екстремитетите и се критични за слухот, перцепцијата на гравитацијата и проприоцепцијата.13,16,19,20,21,22AP, имидаклоприд и пираклостробин го стимулираат комплексот Nan-Iav преку уникатен механизам, што на крајот ја инхибира проприоцептивната трансдукција на сигналот.13,16,23Кај инсектите што прободуваат и цицаат (хемиптерани) како што се лисните вошки и белите мушички, губењето на проприоцепцијата ја нарушува нивната способност за хранење, што на крајот доведува до смрт.13,24Интересно е што AP покажува висок афинитет за комплексот Nan-Iav и низок афинитет само за Nan. Врзувањето на AP за Nan-Iav индуцира електрична струја, но врзувањето само за Nan не ја стимулира активноста на каналот. Самиот Iav воопшто не се врзува за AP.16Ова укажува дека Nan и Iav можат да се врзат за да формираат различни Nan-Iav канални комплекси (на пр., со различни стехиометриски соодноси или различни распореди во рамките на истиот стехиометриски сооднос) или дека AP може да се врзе на повеќе места. Понатаму, природниот агонист никотинамид (NAM) се врзува за Drosophila Nan-Iav со микромоларен афинитет, покажувајќи ефекти слични на оние на лисните вошки (AP) in vitro.16,25и инхибирање на репродукцијата и исхраната на лисните вошки, што на крајот доведува до нивна смрт25,26Овие податоци покренуваат многу прашања. На пример, останува нејасно како се формира Nan-Iav хетеродимерот, кои места на врзување се користат за модулирање на мали молекули и како овие мали молекули ја регулираат функцијата на каналот со потиснување на проприоцепцијата. Понатаму, причините зошто самиот Nan е неактивен и има низок афинитет за AP, додека Nan-Iav хетеродимерот е активен и се врзува за AP со поголем афинитет, остануваат нејасни. Конечно, малку се знае за Ca2+-зависната регулација на Nan-Iav функцијата и како таа е интегрирана во невронските сигнални процеси.. 13,21
Во оваа студија, комбинирајќи крио-електронска микроскопија, електрофизиологија и техники на врзување на радиолиганди, го разјаснивме склопувањето на Nan-Iav и механизмот на неговото врзување за регулатори на мали молекули. Понатаму, детектиравме конститутивно врзан калмодулин (CaM) за Iav и AP-стабилизирани Nan пентамери. Овие резултати даваат важен увид во регулацијата на калциумовите јони во каналите, склопувањето на каналите и факторите што го одредуваат афинитетот на врзување на лигандот. Поважно, потврдивме дека ARD игра централна улога во овие процеси. Нашата студија за комплетни канали за инсекти врзани за релевантни земјоделски пестициди27, 28, 29отвора перспективи за развој на индустријата за пестициди, подобрувајќи ја ефикасноста и специфичноста на пестицидите и овозможувајќи примена на соединенија насочени кон TRPV кај други видови за да се реши глобалната безбедност на храната и ширењето на болести што се пренесуваат преку вектори.
Исто така, откривме дека Nan-Iav е регулиран од Ca2+, а механизмот на регулација е посредуван од конститутивно врзан CaM. Важно е да се напомене дека оваа Ca2+-зависна регулација на Nav од CaM значително се разликува од механизмите на регулација на други јонски канали (на пр., напонски-зависни Na+ канали и TRPV5/6 канали)52,53,54,55,56,57Во каналот Nav1.2, C-терминалниот домен на CaM спирално се поврзува со C-терминалниот домен (CTD), а Ca2+ индуцира врзување на неговиот N-терминален домен за дисталниот дел од CTD.56Во каналот TRPV5/6, C-терминалниот домен на CaM се врзува за CTH, а Ca2+ индуцира нагорно проширување на неговиот N-терминален домен во порите, со што се блокира пропустливоста на катјоните.53,54Предлагаме модел за функцијата на Nan-Iav-CaM регулирана од Ca2+ (Сл. 4h). Во овој модел, N-терминалниот домен на CaM конститутивно се врзува за C-терминалниот домен (CTH) на Iav. Во состојба на мирување (ниска концентрација на [Ca2+]), C-терминалниот домен на CaM реагира со Nan, стабилизирајќи ја ARD конформацијата и со тоа промовирајќи го отворањето на каналот. Врзувањето на агонист/инсектицид за каналот предизвикува отворање на порите, што доведува до прилив на Ca2+. Ca2+ потоа се врзува за CaM, предизвикувајќи дисоцијација на C-терминалниот домен од ARD на Nan. Бидејќи блокирањето на врзувањето на CaM во суштина го укинува инхибиторниот ефект на Ca2+, оваа дисоцијација ја модулира мобилноста на ARD, со што предизвикува инхибиција или десензитизација зависна од Ca2+. Брзото закрепнување на струите на каналот по елуирање на јони на калциум (Сл. 4g) сугерира дека овој механизам овозможува брзи одговори на невронски сигнали посредувани од Ca2+. Понатаму, објавено е дека C-терминалниот регион на Iav, кој останува слабо разбран, игра и други улоги во таргетирањето на каналите и тековната регулација.21
Конечно, нашата студија ја претставува структурата со висока резолуција на комплексот на инсектицид-инсектицид TRP канали од земјоделско значење - откритие претходно непознато за нас. Имено, ја карактеризиравме структурата и функцијата на инсектскиот канал во човечки клетки (HEK293S GnTi–), а не во клетките на инсектите. Со оглед на растечката отпорност на инсектициди и континуираниот притисок врз безбедноста на храната и патогените, нашата работа обезбедува важни информации што ќе го олеснат развојот на нови инсектициди во корист на здравјето на луѓето и глобалната безбедност на храната. Студиите покажаа дека инсектицидите како што е AP се ефикасни против некои штетници кога се користат според упатствата на етикетата и имаат ниска акутна токсичност за корисните опрашувачи, што ја демонстрира нивната еколошка безбедност.13,16Понатаму, тестирањето на некои AP деривати врз комарци покажа дека тие на крајот ја губат способноста да летаат. Разбирањето како овие модулирачки соединенија се врзуваат за Nan-Iav ќе го олесни модификацијата на постојните соединенија или развојот на нови соединенија за поефикасни ипрецизенконтрола на штетници. Нашата студија покажува дека интерфејсот Nan-Iav ARD е клучен не само за регулирање на активноста на ендогените соединенија, пестицидите и Ca2+-CaM, туку и за склопување на каналите. Претпоставуваме дека нарушувањето на склопувањето на хетеродимерите со мали молекули може да биде уникатен и ветувачки пристап за развој на инхибитори на јонски канали.
Од осумте ортологни гени, беа избрани гените со целосна должина на кафеавата бубачка (Halyomorpha halys) Nanchung и Inactive, кои покажаа одлична стабилност во детергентите. Синтетизираните гени беа оптимизирани за кодони за човечка експресија и клонирани во векторот pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) користејќи места за рестрикција XhoI и EcoRI. Ова осигури дека клоновите се во рамка со C-терминалните ознаки GFP-FLAG-10xHis и mCherry-FLAG-10xHis, кои се расцепуваат од HRC-3C протеаза (PPX), овозможувајќи независнаизразПрајмерите што се користеа за клонирање на Nanchung и Inactive во векторот pBacMam беа следниве:
Микроскопски слики од поединечни честички беа добиени на трансмисионен електронски микроскоп (FEI) Titan Krios G2 опремен со K3 камера и енергетски филтер Gatan BioQuantum. Микроскопот работеше на 300 keV, со енергетска поставка од 20 eV, големина на пиксел на примерокот од 1,08 Å/пиксел (номинално зголемување од 81.000x) и градиент на дефокусирање во опсег од -0,8 до -2,2 μm. Снимањето видео беше извршено со 40 слики во секунда со помош на микроскоп Latitude S (Gatan) со номинална брзина на доза од 25 e–px−1 s−1, време на експозиција од 2,4 s и вкупна доза од приближно 60 e–Å−2.
Корекцијата на движењето предизвикано од зракот и пондерирањето на дозата беа извршени на филм со користење на MotionCor2 во RELION 4.061. Проценката на параметрите на функцијата за пренос на контраст (CTF) беше извршена во cryoSPARC со користење на методот за проценка на CTF базиран на крпеница62. Фотомикрографиите со резолуција на прилагодување на CTF ≥4 Å беа исклучени од последователната анализа. Типично, подмножество од 500-1000 фотомикрографии беше користено за избор на точки во cryoSPARC, проследено со неколку рунди на 2D класификација по филтрирањето за да се добие јасна референтна слика за избор на честички базиран на шаблон. Честичките потоа беа екстрахирани со користење на гранични кутии од 64 пиксели и 4-кратно групирање. Беа извршени неколку рунди на 2D класификација за да се отстранат несаканите категории на честички. Првичниот 3D модел беше реконструиран со користење на ab initio реконструкција и рафиниран со користење на нерамномерно рафинирање во cryoSPARC. 3D класификацијата беше извршена во cryoSPARC или RELION врз основа на хетерогеност на ARD. Не беше забележана значајна хетерогеност на мембранските домени. Честичките беа рафинирани со користење на методите C1 и C2; честичките со повисока резолуција на C2 беа сметани за симетрични во однос на C2 и импортирани во RELION за Баесово рафинирање. Потоа честичките беа вратени во cryoSPARC за конечно нерамномерно и локално рафинирање. Конечната резолуција и бројот на честички се прикажани во Табела 1.
При обработка на Nan+AP пентамери, истражувавме различни методи за подобрување на резолуцијата на мембранските домени (особено регионот на порите), како што се одземање на сигналот и маскирање на TMD. Сепак, овие обиди беа неуспешни поради потенцијално екстремното нарушување во регионот на порите и целокупната хетерогеност на TMD. Конечната резолуција беше пресметана со користење на маска автоматски генерирана со методот на неуниформна обработка во cryoSPARC, првенствено насочена кон регионот ARD. Со ова се постигна значително повисока резолуција од онаа на мембранските домени (особено регионот VSLD).
Првичните de novo модели на апо формите на Nanchung и Inactive бубачките прво беа генерирани со користење на Coot63, а моделите на Nan и Iav бубачките беа генерирани со користење на AlphaFold264 за да се идентификуваат региони со ниска доверба. Калмодулинското моделирање беше базирано на вклопувања на цврсти тела на моделите за врзување на Ca2+ и моделите без Ca2+ во PDB пристапите 4JPZ56 и 1CFD65, соодветно. Моделите беа рафинирани со користење на сферична рафинираност за да се обезбеди точна стереохемија и добра геометрија. Фосфатидилхолинот, фосфатидилетаноламинот и фосфатидилсеринот потоа беа моделирани како добро дефинирани густини на липиди, а NAM и AP лигандите беа поставени во соодветните густини во тесните споеви. Датотеките со ограничувања беа генерирани од SMILES низата на изоформите со користење на eLOW во PHENIX66. Конечно, моделите беа рафинирани во реален простор во PHENIX со користење на локално пребарување на мрежа и глобална минимизација со ограничувања на секундарната структура. Серверот MolProbity беше користен за рафинирање на моделот и структурна анализа, а илустрациите беа извршени со користење на PyMOL и UCSF Chimera X. 67,68,69 Анализата на отворот беше извршена со користење на HOLE серверот,70 а мапирањето на конзервацијата на секвенцата беше извршено со користење на Consurf серверот.71
Статистичката анализа беше извршена со користење на Igor Pro 6.2, Excel Office 365 и GraphPad Prism 7.0. Сите квантитативни податоци се претставени како средна вредност ± стандардна грешка (SEM). Студентовиот t-тест (двостраен, неспарен) беше користен за споредување на две групи. Еднонасочна анализа на варијансата (ANOVA) проследена со Данетов пост хок тест беше користена за споредување на повеќе групи. *P< 0,05, **P< 0,01, и ***P<0,001 се сметаа за статистички значајни во зависност од дистрибуцијата на податоците. Вредностите Kd, Ki и нивните асиметрични интервали на доверба од 95% беа пресметани со помош на GraphPad Prism 10.
За повеќе детали за методологијата на студијата, ве молиме погледнете го резимето на извештајот за портфолиото на природата што е поврзано во оваа статија.
Првичниот модел беше изграден со користење на калмодулин моделите од базите на податоци PDB 4JPZ и 1CFD. Координатите се депонирани во Банката за податоци за протеини (PDB) под пристапните броеви 9NVN (Nan-Iav-CaM без лиганд), 9NVO (Nan-Iav-CaM врзан за никотинамид), 9NVP (Nan-Iav-CaM врзан за никотинамид и EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM врзан за афенидолпиролин и калциум), 9NVR (Nan-Iav-CaM врзан за афенидолпиролин и EDTA) и 9NVS (Nan пентамер врзан за афенидолпиролин). Соодветните слики од криоелектронска микроскопија се депонирани во Базата на податоци за електронска микроскопија (EMDB) под следните пристапни броеви: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM без лиганд), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM комплекс со никотинамид), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM комплекс со никотинамид и EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM комплекс со афидопиролин и калциум), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM комплекс со афидопиролин и EDTA) и EMD-49849 (Nan пентамерен комплекс со афидопиролин). Суровите податоци за функционалната анализа се презентирани во овој труд.
Време на објавување: 28 јануари 2026 година